[发明专利]一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法

权利要求书

1.一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，其特征在于：是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（?H2AX）的定量测定方法；具体步骤如下：

1) 、细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于以1640培养基为溶剂的细胞培养基中，然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种；96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

2)、细胞染毒：使用细胞培养基将烟气总粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每列6 孔为一组，分别设置7 个不同浓度的烟气染毒组和空白对照组处理，烟气染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 稀释培养液作为空白对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

3)、基于量子点标记荧光免疫法对细胞中?H2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用Tris缓冲液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定细胞；(2)固定好的A549细胞用Tris缓冲液洗涤2次，加入通透液室温孵育20 min；(3) Tris缓冲液洗涤3次，滴加2% BSA封闭液，在37℃湿盒中孵育30min；(4) 加入100 μl含有兔抗人H2AX抗体和小鼠抗人?H2AX抗体组成的一抗混合液，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)Tris缓冲液洗涤3次，加入量子点标记混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育2小时；(6) 向微孔板中加入100 μL的Tris缓冲液，经荧光酶标仪（405nm处激发，在525nm和605nm处检测）测定荧光强度值；

4)、数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后，根据目标物?H2AX与总H2AX含量的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。

2.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述细胞培养基的配制方法为：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

3.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述1%中性甲醛溶液的配制方法为：通过4mL的 40%甲醛和96mL的Tris缓冲液配制。

4.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述Tris缓冲液的配制方法为：1.21g三羟基氨基甲烷和7.6g氯化钠加入到900mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值至7.4，定容止1000mL。

5.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述细胞膜通透液为浓度0.3% Triton X-100液，配制方法：取0.3 ml Triton X-100，加入至100 ml的 Tris缓冲液中，充分混匀后使用。

6.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述封闭液为浓度2%牛血清白蛋白（BSA），配制方法：取2g的BSA用Tris缓冲液充分溶解，定容至100mL。

7.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述混合一抗溶液的配制方法为：使用前取适量兔抗H2AX抗体和小鼠抗?H2AX抗体混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。

8.根据权利要求1所述的定量评价方法，其特征在于：所述量子点标记混合二抗溶液配制方法为：使用前取适量QD 605 nm-羊抗鼠IgG和QD 525 nm-羊抗兔IgG混合，用2% BSA封闭液稀释至所需浓度。