[发明专利]一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价技术，具体说是涉及一种基于量子点标记荧光免疫法对卷烟烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（?H2AX）的定量测定方法。

背景技术

大量证据表明，卷烟烟气会引起细胞DNA损伤，如碱基的氧化损伤、DNA加合物和DNA双键断裂等。其中DNA双链断裂被认为是DNA最严重的损伤，?H2AX作为DNA双链断裂的特异性标志物，被广泛用于细胞DNA损伤的评价。近年来，有大量文献开展了卷烟烟气导致DNA双链断裂的研究。Albino等使用?H2AX来评价卷烟烟气对人类A549肺癌细胞和正常的人支气管上皮细胞基因毒性，发现呈剂量效应关系，进一步研究表明?H2AX与焦油含量正相关，而与卷烟类型和吸烟行为无关。Toyooka等研究证实卷烟主流和侧流烟气暴露于人类A549肺癌细胞，?H2AX呈剂量效应关系且与时间正相关。目前?H2AX的检测方法主要有免疫荧光法、流式细胞技术和高内涵细胞成像技术。这些技术都是利用?H2AX的特异性抗体和荧光分子标记的二抗实现对目标物定量测定的，所用的荧光分子均为传统有机染料。量子点是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机染料相比，量子点具有激发谱宽，发射谱窄，较高的荧光稳定性和较长的衰减寿命等优势。且量子点标记免疫荧光法与普通免疫荧光法相比，荧光信号可显著增强。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而开发的一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，即采用量子点标记荧光免疫法对卷烟烟气诱导的细胞中?H2AX进行定量测定，该方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种卷烟烟气致细胞DNA损伤的定量评价方法，是基于量子点标记荧光免疫法对烟气诱导的细胞DNA损伤标志物磷酸化的组蛋白（?H2AX）的定量测定方法；具体步骤如下：

1．细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于以1640培养基为溶剂的细胞培养基中，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种；96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

2．细胞染毒：使用细胞培养基将烟气总粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每列6 孔为一组，分别设置7个不同浓度的烟气染毒组和空白对照组处理，烟气染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 稀释培养液作为空白对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

3．基于量子点标记荧光免疫法对细胞中?H2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用Tris缓冲液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定细胞；(2)固定好的A549细胞用Tris缓冲液洗涤2次，加入通透液室温孵育20 min；(3) Tris缓冲液洗涤3次，滴加2% BSA封闭液，在37℃湿盒中孵育30min；(4) 加入100 μl含有兔抗人H2AX抗体和小鼠抗人?H2AX抗体组成的一抗混合液，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)Tris缓冲液洗涤3次，加入量子点标记混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育2小时；(6) 向微孔板中加入100 μL的Tris缓冲液，经荧光酶标仪（405nm处激发，在525nm和605nm处检测）测定荧光强度值；

4．数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入量子点标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后，根据目标物?H2AX与总H2AX含量的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。

在本发明中，各种实验试剂的配制方式如下：