[发明专利]一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。我们要对现有技术进行改造。

发明内容

本发明提供一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，技术方案如下：一用氨水控制pH不小于7，当溶氧反弹时开始指数流加方式补料；至诱导浓度时，添加甘氨酸和CaCl₂，并开始恒速流加补料液。

本发明是以突变体E62D-tag1发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。

所述突变体E62D-tag1构建方法如下：

1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体。

其中E62D构建方法如下；

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆或化学全合成方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genbank：EU477523），将其克隆到表达质粒pBB1-1011作为本发明改造中的模板。

a）以上述模板为材料，通过SEQ ID NO.3为上游引物，SEQ ID NO.4为下游引物，PCR获得TG突变体的基因序列，将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4；

SEQ ID NO.2为GAGAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.3为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃1min40s24个循环72℃10min

b）Del1-4基因为模板，对E62进行突变，引物如下。

SEQ ID NO.4为GACAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.5为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4/E62D。

由于C端氨基酸对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用，因此选取在TGase酶C端添加稳定短肽，通过增加其与成熟酶N端或其他区域之间相互作用，提高蛋白稳定性。在蛋白C端添加适当的短肽可提高蛋白稳定性，将7个氨基酸作为稳定短肽插入到Del1-4/E62D谷氨酰胺转氨酶突变体C端，得到对应突变酶为Del1-4/E62D-tag1。

以突变质粒Del1-4/E62D为模板，进行全质粒PCR。引物如下。

SEQ ID NO.6为：

ATCGGTTGCATCATCCTGACGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG

SEQ ID NO.7为CGACCAGCCCTGCTTCACCTCG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min