[发明专利]一种检测生长素类农药或其结构类似物残留的方法

说明书

技术领域

本发明属于农药残留检测方法，特别属于一种生长素类或结构类似物残留的检测方法。

背景技术

农产品中农药残留问题日益受到人们广泛的关注，而生长素类农药，尤其是二氯喹啉、2，4-D等除草剂在水稻等作物田连年大量使用，造成这类除草剂在农产品中残留超标。加强和建立对这类农药残留的检测方法和监测技术研究对保障人们健康，保护生态环境具有重要意义。

目前农产品中农药残留检测方法，大体上可分为两类。一类是理化检测法，它利用农药独特理化性质作为指标来确定农药的种类和浓度。如分光光度法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、毛细管电脉仪技术（CZE），色质联用技术（GC-MS、HPLC-MS），超临界流体色谱技术（SFC），直接光谱分析技术等。但是，这些技术方法中最常用的是气相色谱法和液相色谱法，具有灵敏高、重现性好等优点，但是一些缺点使其应用受到限制，如仪器昂贵、检测成本高、仪器操作需专业人员，前处理要求较高，检测同期长等缺点。

另外一类是生物检测方法，其原理是利用农药独特的生物学效应作为检测农药的指标。首先，在个体或组织水平上，利用农药对敏感生物的独特的生长发育影响、如造成变色、畸形等表观的改变为指标来确定农药的种类和残留量。如用玉米或其它指示植物根长受抑制来检测土壤中磺酰脲类除草剂等。此法不需要仪器和前处理，对各种毒物都可以测定，但敏感生物不易获得且敏感性不易保持，不能精确定量分析。其次蛋白质水平上。如，根据有机磷类农药或氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱碱酯酶（AChE）的抑制效应，开发的速测卡和速测仪，但该方法只能用于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂检测，其灵敏度受温度影响，结果需用标准仪器检验方法进一步确认。再如，利用抗原与抗体的特异性结合的免疫分析法：酶联免疫法（ELISA法），特异性强，灵敏度高，但抗体制备比较困难，不能肯定试样中的农药品种时，有一定的盲目性，易出现假阴，假阳性现象。

生物检测方法比理化检测方法更简单环保，所以应该大力发展生物检测方法。

发明内容

本发明小组惊讶的发现，利用植物中GH3(Gretchen Hagen3)基因可以灵敏的检测植物中生长素类农药或其结构类似物残留。

本发明选择苗期刚离体的大豆叶片（来自3-5叶期植株）作为检测对象，以离体叶片的叶柄部接触吸收被检样品的水溶液，1小时后，提取大豆叶片的总RNA，反转录后用PCR扩增GH3基因，检测处理大豆叶片中GH3表达量变化量。

一方面，本发明提供一种检测液体样本中是否含有生长素类农药或其结构类似物残留的方法，该方法包括：

（1）、摘取苗期大豆叶片，立即把叶柄侵入液体样本中1小时，从药液中取出大豆叶片用于总RNA的提取；同时取清水处理大豆叶片作对照；

（2）、以SKIP16基因为内参，以GH3.6为标志基因；检测GH3基因在步骤1处理过的大豆体内的相对表达量；如果相对表达量大于5以上，则说明书样本中含有生长素类农药或与生长素农药类似的结构。

在一些优选的方式中，内参SKIP16基因的序列为CD397253；GH3基因的序列为XM_003543231.1；检测内参基因的引物序列为GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC；检测GH3基因的引物序列为：CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA和CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。

在一些优选的方式中，相对表达量大于10-15。优选的，相对表达量为10或15.

在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为苯氧羧酸类，二氯喹啉酸或多菌灵中的一种或几种。在另一些优选的方式中，所述的生长素农药为二氯喹啉酸。

在一些优选的方式中，相对表达量的检测采用Real-Time PCR，其条件如下：