[发明专利]用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法

权利要求书

1.一种用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法，其包括：

(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含编码所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸与编码选自下组的变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸可操作连接：

(i)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的亲本前原肽变体，其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端；和

(ii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的亲本前原肽变体，其中所述变体肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端；和

(b)自所述培养基分离所述具有生物学活性的分泌型多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述亲本信号肽或前原肽选自下组：

(a)所述亲本信号肽或前原肽分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22具有优选至少70%同一性、更优选至少75%同一性、更优选至少80%同一性、甚至更优选至少85%同一性、最优选至少90%同一性和甚至最优选至少95%同一性；

(b)所述亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66具有优选至少70%同一性、更优选至少75%同一性、更优选至少80%同一性、甚至更优选至少85%同一性、最优选至少90%同一性；和

(c)所述亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列在严格条件下分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或者它们的全长互补链发生杂交，其中所述严格条件定义为在比计算的T_m低5℃到10℃的温度在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH 7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1X Denhardt氏溶液,1mM焦磷酸钠,1mM磷酸二氢钠,0.1mM ATP,和0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，并在比计算的T_m低5℃到10℃的温度在6X SCC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟和使用6X SSC洗涤两次各15分钟。

3.权利要求1的方法，其中所述亲本信号肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17或其保留指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力的肽片段，或者由它们组成；且其中所述亲本前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22或其保留指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力的肽片段，或者由它们组成。

4.权利要求1的方法，其中在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的所述亲本前原肽变体选自下组：

(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的变体前原肽；

(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys取代的变体前原肽；

(c)在与前原肽SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体；

(d)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代或由进行了R2K取代的SEQ ID NO:2氨基酸1-22组成的变体前原肽。