[发明专利]用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法

说明书

本申请是申请日为2007年7月13日、申请号为“200780033511.1”(国际申请号为“PCT/US2007/073455”)、名称为“用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于产生分泌型多肽(secreted polypeptide)的方法。本发明还涉及变体信号肽(variant signal peptide)或变体前原肽(variant prepropeptide)，及包含与编码多肽的多核苷酸可操作相连接的所述变体信号肽或变体前原肽编码序列的核酸构建体、载体和宿主细胞。

相关技术的描述

信号肽是以符合读码框的方式(in frame)连接至具有生物学活性的多肽的氨基末端并指导所编码的多肽进入细胞的分泌途径的氨基酸序列。前原肽指位于多肽的氨基末端的氨基酸序列，其中所得多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)，或者在有些情况中称为酶原(zymogen)。多肽原一般是没有活性的，而且可以通过催化性地或自身催化性地自多肽原切割掉前肽(propeptide)而转变成成熟的、有活性的多肽。若多肽的氨基末端存在有信号肽和前肽两个区，则前肽区以符合读码框的方式连接至多肽的氨基末端，而信号肽区以符合读码框的方式连接至前肽区的氨基末端。

特定宿主细胞中感兴趣的重组多肽的分泌可能要求将其天然信号肽替换成与所选择的宿主细胞相容的新信号肽。另外，多肽的前肽序列可能还需要用不同前肽序列替换或缺失，因为前肽序列没有得到宿主细胞的加工或者得到宿主细胞的不正确加工，而前肽序列需要得到宿主细胞的正确加工才能分泌活性多肽。在其它情况中，可以不存在信号肽和/或前肽。

通过突变来修饰与多肽天然相关的天然信号肽或天然前原肽从而改善感兴趣多肽的分泌可以是有可能的。

Belin等,2004,Journal of Molecular Biology 335:437-453描述了改善纤溶酶原激活物抑制物2(PAI-2)信号序列的功能活性的突变。Tsuchiya等,2003,Nucleic Acids Research Supplement No.3,pp.262-262描述了用于在酵母中有效分泌人溶菌酶的信号序列的突变。Nothwehr和Gordon,1990,The Journal of Biological Chemistry 265:17202-17208描述了人前(Δ原)载脂蛋白A-II信号肽氨基末端区中影响信号肽酶对其切割的位点的结构特征。Ngsee和Smith,1990,Gene 86:251-255描述了酵母中的有效分泌所需的牛促乳素(bovine prolactin)信号肽中的变化。

美国专利No.5,766,912披露了来自细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)的全长野生型脂肪酶的克隆过程和序列，所述脂肪酶包含前原肽序列。美国专利No.5,869,438披露了来自细毛嗜热霉的全长野生型脂肪酶的变体。

本领域需要改进的信号肽和前肽序列用于各种宿主细胞中活性多肽的分泌。

本发明的一个目的是提供使用变体信号肽或变体前原肽在真菌宿主细胞中产生多肽的改进的方法。

发明概述

本发明涉及用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法，其包括：

(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含编码所述多肽的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸与编码选自下组的变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸可操作连接：

(i)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的亲本信号肽变体，其中所述变体信号肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端；

(ii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置包含缺失的亲本前原肽变体，其中所述变体肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端；

(iii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的亲本前原肽变体，其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端；和

(iv)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失的亲本前原肽变体；并