[发明专利]一种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法

说明书

本发明公开了一种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、避免假阳性、快速（常规50分钟完成检测）地对含有VP RNA的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及食源致病性微生物的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的副溶血弧菌（VP）的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，VP)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌，该菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血性弧菌污染。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均己超过沙门氏菌食物中毒，跃居首位。

目前副溶血弧菌检测方法主要有分离培养方法及分子生物学方法。分离培养法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要5～7 天完成，不能满足快速检测的要求。分子生物学方法有PCR方法和LAMP方法。PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点，但这类方法通常检测成本高，需要比较昂贵的PCR仪，对实验环境和操作者技术要求也比较高。LAMP方法不需要昂贵仪器，操作也简便。但以上两种方法检测靶标均为DNA，不能区分活菌与死菌，容易发生假阳性结果。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行（42℃）， 无需热循环。SAT技术直接以病原微生物特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，在自然界中病原微生物死亡后靶标RNA会快速降解，而DNA会存在一段时间，通过对目标RNA的检测，可实现食品致病菌活菌检测，降低假阳性。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，避免假阳性，设备简单，成本低的VP RNA检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种副溶血弧菌VP的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO: 3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO: 4所示。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的捕获探针。

在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的检测探针。

在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。

在另一优选例中，所述的检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记DABCYL淬灭基团。

在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

在另一优选例中，所述的捕获探针可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。

在另一优选例中，所述方法还包括：在另一阳性(对照)反应体系或阴性(对照)反应体系中进行扩增反应。

在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、VP内标(VP ICRNA)、所述捕获探针和所述检测探针。