[发明专利]利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多克隆抗体制备技术，尤其涉及一种制备家蚕丝蛋白特异抗体的技术。

背景技术

家蚕是我国重要的经济昆虫，以产生蚕丝为目的。蚕丝主要由丝素和丝胶两种蛋白质组成，但丝胶蛋白在缫丝过程中脱落，因此，丝织品、丝绸产品等中主要的成分是丝素蛋白。一方面，目前在纺织品市场，假冒丝绸产品较多，侵犯了消费者权益，严重影响了我国丝绸长期以来的良好声誉，因此，有必要建立科学严谨的检测分析方法。另一方面，在丝绸起源研究领域，也迫切需要更科学的分析方法，因为古代埋入墓葬或遗址中的丝织品随着时间的推移，易受多种因素影响而遭到降解，外界的光照、酸、碱、微生物等环境因素，都会造成蚕丝蛋白质发生变性和大分子链的断裂，使之降解成肽段或氨基酸，因此利用传统由天然蛋白质大分子制备的抗体很难来检测这样已经遭到破坏的抗原蛋白，这样就很难来探寻丝绸的起源，且年代越早的证据越难寻觅。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕、残留物、土壤中提取古代丝绸的信息，对丝绸起源研究非常迫切。目前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的Western Blotting或ELISA方法，但制备抗体常采用天然蛋白质大分子，因此，无法满足上述研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用特征十二多肽制备家蚕丝蛋白特异抗体的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明利用特征十二多肽制备家蚕丝蛋白特异抗体的方法包括以下步骤：

    步骤一： 利用多肽合成仪合成序列为“CGYGAGAGAGYGA” 的多肽，将该多肽和匙孔血蓝蛋白（KLH）偶联起来得到完全抗原；

步骤二：用生理盐水稀释所述完全抗原，将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，然后进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液；使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫，然后对兔子进行加强免疫，加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液；所述加强免疫抗原乳化液是由所述稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，然后进行乳化处理得到；当兔子的抗血清效价达到1/10000后，收集免疫后的兔子的血液，并使血块充分收缩及抗血清完全析出，收集抗血清并离心处理得到上清液。

进一步地，本发明在所述步骤二中，在配制初次免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合；在配制加强免疫抗原乳化液时，稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂是按体积比1:1进行混合。

进一步地，本发明在所述步骤二中，对兔子进行所述初次免疫的方法是：使用初次免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100ul；

对兔子进行所述加强免疫的方法是：在初次免疫后的第2、4、6周分别进行一次加强免疫，每次加强免疫是使用加强免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射，每只注射100ul。

进一步地，本发明在所述步骤二中，使血块充分收缩及抗血清完全析出的方法是：将所收集的血液置室温下让其凝固，然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30 min，再置于4℃冰箱过夜。

 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

    （1）本发明方法实施的结果表明，通过家蚕丝素蛋白特征十二多肽制备的多克隆抗体具有很强的特异性，经ELISA分析，该抗体与家蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高，能够用于检测家蚕丝素蛋白，特别适合用于不完整丝素蛋白的检测分析。 

    （2）与传统方法利用天然蛋白质的大分子制备的抗体不同，本发明制备的抗体不仅能够检测完整的丝素蛋白，也能用于检测诸如古代丝织品中已经断裂的丝素蛋白分子，在考古、文物鉴定和其他科学研究中具有重要作用。

具体实施方式

在PubMeD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）上下载家蚕（Bombyx mori ）丝素蛋白的重链(H-chain)氨基酸序列（如SEQ No.1所示）。通过统计分析，确定“GYGAGAGAGYGA”多肽片段出现频率很高，合计47处，是家蚕丝素的特征多肽，故合成此片段作为抗原来制备抗体。