[发明专利]一种黑曲霉组成型表达元件、表达载体、重组黑曲霉及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程研究领域，具体涉及一种黑曲霉组成型表达载体及其应用。

背景技术

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，某些丝状菌分泌的胞外总蛋白量达到40g/L，这种高效的蛋白分泌能力是细菌等原核表达宿主所不能比拟的。丝状真菌还具备各种基因翻译后加工能力，如糖基化修饰，信号肽切割及二硫键的形成等。米曲霉，黑曲霉及里氏木霉等丝状真菌都是食品安全级菌株，被美国食品与药品管理局认定为GRAS（Generally recognized as safe）菌株。在工业用酶的生产中丝状菌发酵占据核心的地位，国际市场的酶制剂将近40%的酶类生产来自于丝状真菌发酵。

黑曲霉是一种重要的工业微生物，可以用于淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等多种酶制剂发酵制备。随着黑曲霉的基因组测序工作的完成，为深入研究黑曲霉蛋白分泌表达及其调控机制奠定了良好的基础，同时也为通过基因工程手段提高黑曲霉的异源蛋白表达能力提供了新的思路和方法。

黑曲霉是葡萄糖化酶的高产菌株，表明糖化酶基因的启动子具有高效转录的作用，因此该基因的启动子被开发用于高表达载体的启动子。此外，Sucrase A,、α-Amylase、Alcohol dehydrogenase I及Arabinanase等基因的启动子序列被相继开发为表达载体的启动子元件。但这些表达载体在表达外源基因时，需要加入麦芽糖、淀粉、蔗糖等物质进行诱导。对于重组蛋白的工业生产，一方面增加了生产成本，另一方面有可能增加发酵液中背景蛋白的产生，增加了重组蛋白纯化的难度。

相对于诱导型的启动子，组成型的启动子不需要添加诱导物即可以进行基因的启动表达，在实际生产中可以降低生产的成本，因此更具有应有的价值。在其他表达系统中，如毕赤酵母，米曲霉表达系统，木霉表达系统都相继开发出高效的组成型表达载体。转录延伸因子基因（Transcription elongation factor1，tef1）是黑曲霉中重要的看家基因，控制细胞内大量基因转录过程，其启动子序列有可能是组成型的启动子并用于高效载体的构建。Storms R等人（Storms R et al.Plasmid vectors for protein production,gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger.2005,Plasmid53:191–204）报道了含有黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子的黑曲霉组成型启动子的表达载体。到目前为止，还没有利用黑曲霉Tef启动子构建表达载体的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需添加诱导物即可进行外源基因表达的黑曲霉组成型表达元件。

本发明的第二个目的在于提供一种含有所述黑曲霉组成型表达元件的表达载体及构建方法。

本发明的第三个目的在于提供含有所述表达载体的重组黑曲霉及构建方法。

本发明的第四个目的在于提供上述重组黑曲霉的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种黑曲霉组成型表达元件，所述表达元件由黑曲霉转录延伸因子基因启动子和黑曲霉转录延伸因子基因终止子组成；所述黑曲霉转录延伸因子基因启动子由1490、990或690个碱基组成，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；所述黑曲霉转录延伸因子基因终止子由1022个碱基组成，序列如SEQ ID NO.5所示。

上述黑曲霉组成型表达元件构建表达载体的方法，包括以下步骤：

1)提取黑曲霉的基因组DNA，设计引物，利用PCR技术，并以黑曲霉基因组DNA为模板，扩增并克隆长度为1490、990或690个碱基的黑曲霉转录延伸因子基因的启动子和长度为1022碱基的终止子，分别命名为P_tef1490、P_tef990、P_tef690、和T_tef；

2）将Amds基因通过kpnI和XhoI内切酶克隆进入pbluescript载体中，获得中间载体一；将P_tef基因片段利用XhoI和HindIII内切酶克隆进入上述中间载体一中，获得中间载体二；将T_tef基因片段利用XbaI和NotI克隆进入中间载体二，获得黑曲霉表达载体pTef。

所述引物序列如下：