[发明专利]两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法

权利要求书

1.两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：其以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在同一个反应体系，利用生物催化剂，通过两步催化反应，在水相缓冲液中反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，过程中不需对中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化。

2.根据权利要求1所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述的两步催化反应为，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯在含有重组酮还原酶KRED1基因的大肠杆菌细胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，第二步(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在含有卤醇脱卤酶HHDH基因的大肠杆菌的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。

3.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述的含有重组酮还原酶KRED1的大肠杆菌细胞的制备方法为：将含有重组酮还原酶KRED1基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KRED1的大肠杆菌全细胞。

4.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述的含有卤醇脱卤酶HHDH基因的大肠杆菌的制备方法为：将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD600值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2～8倍体积的2mM，pH7.0的三乙醇胺缓冲液悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4℃下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。

5.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述第一步反应起始时的反应体系中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度为10％～30％(w/v)，重组酮还原酶KRED1基因的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的0.5％～8.0％(w/w)，异丙醇的浓度为总反应体系的3％～15％(w/v)，所述不对称还原反应在pH为6.0～8.0 的50mM的水相磷酸盐缓冲液中进行，反应体系的温度为30℃。

6.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：在第一步反应体系中加入的Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子，浓度为0.5-20mM。

7.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：第一步反应结束后，加入pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，然后在真空度0.05 MPa的条件下把温度升至50℃后保持10min，加入卤醇脱卤酶HHDH液开始第二步反应。

8.根据权利要求7所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：第二步反应起始时的反应体系中，加入氰化钠磷酸溶液的终浓度为2％～6％(w/v)；所述的第二步反应过程中卤醇脱卤酶HHDH液的用量为反应总体积的0.5％～4.0％(w/v)，反应体系的温度为45～50℃；还用30%的NaCN溶液控制体系的pH至6.8～7.3。