[发明专利]两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种两步生物催化耦联制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法。 

背景技术

他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物。其中最有代表性的是阿托伐他汀（Atorvastatin）和罗素伐他汀（Rosuvastatin），前者是世界上首款销售额突破百亿美金的药物，而后者则是迄今为止降脂效果最好的他汀类药物，又被成为“超级他汀”。最近又有大量的临床研究结果表明：他汀类药物除了是最有效的降低胆固醇的药物，而且对骨质疏松症、老年痴呆症、心脏病和糖尿病等各种疾病都有显著疗效，如果进一步开发新适应症，他汀类药物无疑将会有更大的的临床应用范围。作为他汀类药物的关键手性中间体的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，市场的需求量会越来越大。 

(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学法的反应条件苛刻，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相比较而言，生物法的反应条件温和，更加实用和环保。目前研究主要是利用(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，在卤醇脱卤酶的作用下脱卤加氰基得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。国内专利CN 101760468公开了利用突变到的卤醇脱卤酶催化生产(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，但酶活较低，催化效率低，成本高，不利于大规模工业化生产。在国内专利CN 103014082公开制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法中，添加冻干酶粉，在水相体系中通过补加20%稀硫酸和30%的NaCN溶液控制反应体系的pH，催化剂的成本较高，无法进行大规模产业化应用，而且补入的NaCN溶液严重过量，NaCN是剧毒品，给后提取和操作环境安全隐患，不利于绿色环保的要求。 

同时，由于所用底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯也是由生物法获得，一般是先提取得到纯品的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，再进行下一步反应，目前也尚无不经纯化中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，直接进行下一步反应的报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种两步法催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法反应步骤简单、成本较低、减少了有机溶剂和剧毒品的使用量，是一种绿色生产方法。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：其以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物，在同一个反应体系，利用生物催化剂，通过两步催化反应，在水相缓冲液中反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，过程中不需对中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化。 

所述的两步催化反应为，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）在含有重组酮还原酶KRED1基因的大肠杆菌细胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，第二步(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在含有卤醇脱卤酶HHDH的大肠杆菌的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。整个过程在同一个水相体系中进行，第一步反应结束后不需对中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化直接进行第二步反应。 

所述的含有重组酮还原酶KRED1基因的大肠杆菌细胞的制备方法为：将含有酮还原酶KRED1基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KRED1的大肠杆菌全细胞。