[发明专利]荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全中β₂-受体激动剂残留检测领域，具体涉及一种用荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的偶联物及其制备方法。

背景技术

克伦特罗(clenbuterol)作为一种β₂-受体激动剂能起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，常以其盐酸盐的形式使用，在临床上能用于人和动物哮喘类病症的治疗。但用超过治疗剂量的盐酸克伦特罗长期给动物饲喂时，它在动物体内具有营养再分配作用，能显著提高瘦肉率及减少脂肪率，故很多不法分子常将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂用于动物饲养中，从而使肉品瘦肉率增加、提早上市、降低成本。盐酸克伦特罗的滥用势必会在畜产品中残留，而给人类的健康带来相当大的威胁。

免疫层析技术由于具有快速、准确、方便的优点，在盐酸克伦特罗及其替代物的检测应用上已得到很大的推广，它是以抗原抗体间的特异性反应为基础，通过标记物对某种物质进行定性或定量检测的研究手段。目前，常用于免疫层析技术检测盐酸克伦特罗的标记物有胶体金、荧光微球等，这些标记物保持了克伦特罗单克隆抗体的活性，而标记物的活性不受影响，当它与相应抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，直接对目标物质进行定性甚至定量分析。

目前，标记物与抗体之间大多是通过共价键或物理吸附的方式直接偶联，特别是β-受体激动剂抗体的标记。该种偶联方式有偶联时间短、操作简单的优点，但这种偶联方式，由于抗体任意与标记物结合使一些抗原结合位点被屏蔽，即所谓的空间位阻，导致抗体标记效率和标记物的分散性降低。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法，该方法减少了抗体与荧光微球相连的空间位阻，提高了标记效率高，制得的偶联物能表现出良好的胶体稳定性和结合性能。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体的方法：(1)氨基修饰的荧光微球与活泼酯化的生物素在PBS溶液中偶联反应2 h得到荧光微球-生物素偶联物，再离心、洗涤除去未结合的生物素；(2)将链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合轻摇反应2 h后，离心、用PBS溶液洗涤移除未偶联的链霉亲和素，得到荧光微球-生物素-链霉亲和素偶联物；(3)将生物素化的克伦特罗单克隆抗体加入到荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物溶液中轻摇反应1 h后，洗涤、离心以除去未偶联上的生物素化克伦特罗单克隆抗体，即得到荧光微球标记克伦特罗单克隆抗体即荧光微球-生物素-链霉亲和素-生物素化克伦特罗单克隆抗体；所述活泼酯化的生物素为将生物素-PEG5000复合物溶于DMF溶液中，加入二环己基碳亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺后室温搅拌反应24 h，然后离心弃沉淀，得到活泼酯化的生物素；所述氨基修饰的荧光微球的制备方法：10 mg荧光微球洗净后超声溶解于1 mL蒸馏水中，加入20 μL冰乙酸和20 μL(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超声溶解后，磁力搅拌3～4 h，用10 mM pH5.5的MES缓冲液洗涤并重悬；所述荧光微球粒径为175 nm。

所述生物素化克伦特罗单克隆抗体的的制备方法：用1 mL DMSO溶液溶解生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯NHSB配制成浓度为1 mg/mL的溶液，取120 μL加入到1mL克伦特罗单克隆抗体溶液中，在室温下持续搅拌，保温2~4 h；然后加入9.6 μL 1 mol/L的NH4Cl 溶液在室温下搅拌10 min，用PBS溶液在4℃下充分透析除去游离的生物素；将透析完后的样品上1 ml 的分子筛柱，以PBS溶液缓慢洗脱，抗体在1~3 ml 之间洗下，再在收集到的目标产物中加入叠氮钠及1.0 g/L的BSA溶液，在4 ℃下避光保存备用。

所述链霉亲和素与荧光微球-生物素偶联物混合反应的投料摩尔比为1000:1。

所述荧光微球标记生物素化克伦特罗单克隆抗体与荧光微球-生物素-链霉亲和素的偶联物的投料摩尔比为1:1000。

本发明的有益效果是：

1、标记效率高：与传统的荧光微球直接偶联抗体相比，生物素-链霉亲和素作为偶联臂使荧光微球与克伦特罗单克隆抗体之间结合的空间位阻效应减小，而且一个荧光微球-PEG₅₀₀₀-生物素-链霉亲和素能与生物素化抗体1:4的偶联，从而使标记效率得到了相应地提高。