[发明专利]一种利用抗菌肽融合表达提高转基因植物抗病性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是汲及一种利用多种或多拷贝同种抗菌肽在植物叶片或其它器官融合表达后再剪切为单个有活性的抗菌肽的方法，在作物中高丰度表达广谱高效抗菌肽的技术，用于增强农作物抗病性。

背景技术

抗菌肽是生物体防御系统中产生的一类对外源病菌具有高效杀灭活性的肽类物质，特别是一些动物来源的抗菌肽，如天蚕素(Cecropins)、蜂毒素(Melittins)、蛙皮素(Magainins)等，对细菌、真菌、病毒、螺旋体等多种病原菌甚至癌细胞都有一定的杀灭活性，而且长期使用不会使病原菌产生耐药性，也不存在残留污染问题，是抗生素和化学杀菌剂的理想替代品。

由于抗菌肽具有高效、环保、不使病源菌产生耐药性等优点，近年来，已成为植物抗病基因工程、养殖饲料添加剂、新兴医药等领域的研究热点。特别是在植物抗病基因工程领域，抗菌肽基因资源成为最有潜力和应用价值的资源之一。然而，动物源抗菌肽基因转入植物后所遇到的主要问题就是抗菌肽表达丰度偏低，限制了抗菌肽功效的发挥。虽然基因的转录后表达很复杂，与多种因素有关，但这种动物源抗菌肽在植物细胞表达偏低的现象普遍认为主要是外源抗菌肽在植物细胞不够稳定，容易被细胞内的蛋白酶降解的原因。

1997年，Tailor等发现凤仙花(Impatiens balsamina L.)种子天然抗菌肽的前体蛋白是由引导肽和连续6个长度为20个氨基酸的成熟肽单元串联融合组成，各成熟肽单元之间由保守的蛋白酶剪切位点隔开，前体蛋白翻译后可在胞间溶胶中自动剪切为各成熟抗菌肽单元。本发明利用了该内肽酶识别位点，设计了可自动剪切的抗菌肽基因多拷贝串联融合表达技术，并结合其它外源蛋白增强表达技术，以增强抗菌肽在植物体内的表达丰度和稳定性，提高作物抗病效果。

中国专利文献(公开日：2009年4月1日，公开号：CN101397559A)公开了一种增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方法，属于生物技术领域，它通过设计了一种在植物体内可自动剪切的多拷贝抗菌肽串联融合表达技术，使多拷贝融合表达的抗菌肽在植物体内可自动剪切为有功能活性的单个抗菌肽单元，以增加抗菌肽表达丰度和抗菌肽的稳定性。

中国专利文献(公开日：2011年11月30日，公开号：CN102260325A)公开了涉及一种抗菌肽NX-16及其制备方法与应用。本发明设计了一种抗菌肽NX-16的氨基酸序列；根据大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了抗菌肽NX-16的原核表达串联基因；用重叠区扩增拼接PCR法合成目的基因；采用酶连接法构建表达载体，并转化于大肠杆菌中进行了表达，表达产物酶解后即得。本发明通过修饰抗菌肽基因后，于大肠杆菌中进行高效串联表达(表达产物为抗菌肽多个分子的聚合肽，不具有抑菌活性，对大肠杆菌本身也不具有杀灭或抑制作用)，然后通过酶解法获得具有抗菌活性的抗菌肽分子，该抗菌肽在制药行业和畜牧业上具有广阔的应用前景；本发明制备方法表达效率高，分离纯化简单，易操作，稳定性好。

中国专利文献(公开日：2012年3月14日，公开号：CN102372782A)公开了昆虫抗菌肽DSP融合蛋白及其在植物抗病中的应用。本发明所提供的昆虫抗菌肽DSP融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。抗病性检测的结果显示，DSP转基因拟南芥对白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)等真菌具有明显的抗性。证明DSP在控制植物真菌病害方面效果明显，具有一定的应用价值。

生物技术通报2009年第2期公开了张鑫、苗向阳、尹逊河、马艳芳、曲朝杰、张秋婷等人发表的《抗菌肽在转基因动植物中的研究进展》一文，文中就抗菌肽的特性、抗菌机理及其在转基因动植物中的研究作了简要论述。

发明内容

本发明的目的是针对异源抗菌肽在转基因植物体内表达丰度偏低，易被植物内源蛋白酶降解的问题，而提供一种利用多种抗菌肽或同种抗菌肽多拷贝融合表达来提高抗菌肽的表达丰度，增强转基因作物的抗病性的方法。