[发明专利]一种制备单宁酶的方法

权利要求书

1.一种制备单宁酶的方法，包括以下步骤：

(1)种子扩大培养：将无花果曲霉斜面菌种接入摇瓶扩大培养；

(2)配置发酵培养基：以玉米粉、豆粕混合物或蔗渣、麸皮混合物作发酵培养基底物，加入盐溶液，灭菌、冷却；

(3)单宁酶发酵：培养基冷却后，接入1mL无花果曲霉菌悬液，恒温发酵；

(4)粗酶液制备：往恒温发酵结束后的发酵培养基加入pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，置于摇床震荡提取90min，过滤，收集粗酶液；

(5)单宁酶纯化。

2.根据权利1所述的制备单宁酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的玉米粉、豆粕混合物由玉米粉、豆粕以2︰1的质量比均匀混合而成，蔗渣、麸皮混合物是由蔗渣、麸皮以1︰1质量比均匀混合制成，培养基底物和加入的盐溶液成6︰7质量体积比比例，每升盐溶液含有10gNH₄Cl、1gKCl、2gK₂HPO₄、1gMgSO₄·7H₂O。

3.根据权利1所述的制备单宁酶的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的无花果曲霉悬液为无花果曲霉Gim3.6(购于广东省菌种保藏中心)悬液，浓度为1×10⁸个孢子/mL，单宁酶发酵条件为35℃恒温发酵65h。

4.根据权利1所述的一种制备单宁酶的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的发酵培养基与pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰10质量体积比，摇床摇速为160r/min。

5.根据权利1所述的制备单宁酶的方法，其特征在于：单宁酶纯化包括三种方法。

6.根据权利1或5所述的单宁酶纯化，其特征在于：第一个方法是硫酸铵分级沉淀法，往粗酶液中加入饱和度为30%～70%硫酸铵，收集沉淀，加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰1体积比的5℃的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。

7.根据权利1或5所述的单宁酶纯化，其特征在于：单宁酶纯化的第二个丙酮沉淀法，往粗酶液中加入-20℃丙酮，4℃静置3h，6000r/min离心分离20min，收集沉淀，加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰1体积比的5℃的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。

8.根据权利1或5所述的单宁酶纯化，其特征在于：单宁酶纯化的第三个方法是反胶团萃取法，将收集到的粗酶液作为水相，以1︰1体积比加入有机相75mmol/L CTAB-异辛烷反胶团溶液，在200r/min摇床上震荡混合13min，4000r/min离心分离5min，取有机相，按1:1体积比加入反萃取水相0.5mol/L NaCl溶液，在200r/min摇床上震荡混合30min，4000r/min离心分离5min，获取水相，用聚乙二醇6000包埋浓缩，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。