[发明专利]一种制备单宁酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备单宁酶的方法，属于生物发酵领域。 

背景技术

单宁酶（Tannase EC3.1.1.20），又称单宁酯酰水解酶，是一种诱导酶，能由某些微生物在单宁酸等诱导物存在时诱导合成。单宁酶能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和其他化合物。单宁酶广泛应用于饮料、酿酒、医药、制革、化妆品等领域，特别是在制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯以及在处理茶叶“冷后浑”和啤酒沉淀等方面，具有重要的应用价值。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备单宁酶的方法。 

本发明的目的通过如下技术方案实现： 

一种制备单宁酶的方法，包括以下步骤： 

(1)种子扩大培养：将无花果曲霉斜面菌种接入摇瓶扩大培养； 

(2)配置发酵培养基：以玉米粉、豆粕混合物或蔗渣、麸皮混合物作发酵培养基底物，加入盐溶液，灭菌、冷却； 

(3)单宁酶发酵：培养基冷却后，接入1mL无花果曲霉菌悬液，恒温发酵； 

(4)粗酶液制备：往恒温发酵结束后的发酵培养基加入pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，置于摇床震荡提取90min，过滤，收集粗酶液； 

(5)单宁酶纯化。 

步骤(2)中所述的玉米粉、豆粕混合物由玉米粉、豆粕以2︰1的质量比均匀混合而成，蔗渣、麸皮混合物是由蔗渣、麸皮以1︰1质量比均匀混合制成，培养基底物和加入的盐溶液成6︰7质量体积比比例，每升盐溶液含有10gNH₄Cl、1gKCl、2gK₂HPO₄、1gMgSO₄·7H₂O。 

步骤(3)中所述的无花果曲霉悬液为无花果曲霉Gim3.6(购于广东省菌种 保藏中心)悬液，浓度为1×10⁸个孢子/mL，单宁酶发酵条件为35℃恒温发酵65h。 

步骤(4)中所述的发酵培养基与pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰10质量体积比，摇床摇速为160r/min。 

步骤(5)中所述的单宁酶纯化包括三种方法，单宁酶纯化包括三种方法，方法一是硫酸铵分级沉淀法，往粗酶液中加入饱和度为30%～70%硫酸铵，收集沉淀，加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰1体积比的5℃的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉；方法二是丙酮沉淀法，往粗酶液中加入-20℃丙酮，4℃静置3h，6000r/min离心分离20min，收集沉淀，加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1︰1体积比的5℃的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉；方法三是反胶团萃取法，将收集到的粗酶液作为水相，以1︰1体积比加入有机相75mmol/LCTAB-异辛烷反胶团溶液，在200r/min摇床上震荡混合13min，4000r/min离心分离5min，取有机相，按1:1体积比加入反萃取水相0.5mol/L NaCl溶液，在200r/min摇床上震荡混合30min，4000r/min离心分离5min，获取水相，用聚乙二醇6000包埋浓缩，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。 

用无花果曲霉发酵生产单宁酶，发酵周期短，发酵工艺简单，培养过程易于控制。反胶团萃取技术对粗酶液进行纯化，经济适用，容易进行工业化生产。 

附图说明

图1为本发明单宁酶制备工艺流程。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可 以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1