[发明专利]一种酶促制备(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的生物制备方法。

背景技术

(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯是制备(S)-奥拉西坦的一个必不可少的关键中间体，其结构如下：

(S)-奥拉西坦是一种促智药，能改善提高人的思维，记忆力和学习能力。奥拉西坦临床上用于轻中度血管性痴呆、老年性痴呆以及脑外伤等症引起的记忆与智能障碍。目前临床使用的都是外消旋体奥拉西坦，国内外大量资料表明(S)-奥拉西坦的药效明显优于(R)-奥拉西坦。大量实验证明，与外消旋体奥拉西坦相比，(S)-奥拉西坦可以显著改善由于东莨菪碱造成的小鼠学习记忆能力损伤。然而，目前国内外均未见(S)-奥拉西坦上市。(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯（I）的合成路线目前国内外报道的主要都是通过纯化学方面合成，如硼氢化钠还原，硼烷还原，金属参与的不对称还原，这些方法在产业化方面都受到很大的局限性。稀有金属参与的不对称还原成本太高；硼氢化钠或硼烷等还原在产业化上危险性高，且三废难以处理。

中国现已申请的同类发明专利例如申请号200810124754.2、201010213724.6、201110225388.1、201210069347.2等公开了数种酮还原酶制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法均采用昂贵的辅酶因子NAD或NADP，并需要添加葡萄糖或异丙醇等作为氢供体，且必须添加有机溶剂形成两相体系，并且需要分批补料加入底物，操作繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种酶促制备(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯的方法，其以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，使该底物在酮还原酶的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，特别是，所述的酮还原酶为胞内酶，且为整细胞酶，且使反应在pH6.5～7.5的水相缓冲液中以及温度35～38℃下进行，其中不使用辅酶因子、不添加有机溶剂。

根据本发明，所述的水相缓冲液可以为磷酸钾缓冲液、乙酸钠缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

优选地，使反应在一价或二价金属离子存在下进行。进一步地，所述的金属离子可以为Li⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺Zn²⁺、Mn²⁺中的一种或多种的组合。金属离子可以其盐酸盐或硫酸盐的形式引入到反应的体系中。金属离子与底物的摩尔比为0.01～0.03:1。

优选地，所述的酮还原酶为酶活在60U/ml～70U/ml之间的Cell KRED-022酶液（可从例如尚科生物医药(上海)有限公司商购）。

根据本发明的一个具体和优选方面，所述的反应实施如下：向反应釜中加入水相缓冲液，打开搅拌并开始加热，待反应釜中温度稳定在35～38℃后，将底物一次性加入到反应釜中，再加入所述酮还原酶，进行反应，HPLC跟踪反应进程，至底物转化完全后，反应停止，直接用乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤，分出乙酸乙酯，干燥浓缩即得(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯。

进一步地，在加入底物前，还向体系中加入一价或二价金属离子的盐酸盐或硫酸盐。金属离子可以为Li⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺Zn²⁺或Mn²⁺。

根据本发明，底物在体系中的浓度可以发生变化，但是通常浓度为1mM～2M，优选0.1M～1M。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明方法与已有的生物制备方法相比，无需使用昂贵的辅酶因子，也无需使用有机溶剂，成本更低，操作更简单，且底物转化率高，产品收率高，因而本发明方法更适于工业化生产。

具体实施方式

1、本发明所用的酮环酶及其活性测定

本发明所用酮还原酶为Cell KRED-022酶液，该酶液的酶活在60～70U/ml之间，购自尚科生物医药(上海)有限公司。