[发明专利]检测禾谷镰孢多菌灵抗性相关点突变E198K出现频率的引物及方法

权利要求书

1.一种引物，其特征在于，碱基序列为：

正向引物：5’-AGCTCGTCGAGAACTCTGAAA-3’；

反向引物：5’-GCAGCGGCCATGATGTTCTT-3’。

2.一种检测禾谷镰孢多菌灵抗性相关点突变E198K出现频率的方法，其特征在于，包括：

（1）采样，将样品混合后提取DNA；

（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到混合样品中含E198K点突变的DNA的重量；

（3）根据禾谷镰孢的actin基因设计引物，以所述的DNA作为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得到混合样品中总DNA的重量；

（4）根据下述公式，计算得到多菌灵抗性相关点突变E198K的出现频率：

FRE_E198K=Q_E198K/Q_Fg×100%；

其中，FRE_E198K为多菌灵抗性相关点突变E198K的出现频率，Q_E198K为混合样品中含点突变E198K的DNA的重量，Q_Fg是混合样品中禾谷镰孢总DNA的重量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA的提取方法包括：

（a）采集菌丝或子囊壳，混合后加入提取液研磨；

（b）将研磨后的混合液静置一段时间，离心取上清液；

（c）上清液用醇进行沉淀，沉淀物经洗涤后获得所述的DNA；

从菌丝中提取DNA时，所述的提取液包括：200mM Tris-HCl，50mMEDTA，20mM NaCl和1%SDS；

从子囊壳中提取DNA时，所述的提取液包括：1-2%聚乙烯吡咯烷酮，200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl和1%SDS。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，所述实时荧光定量PCR扩增的体系为：1μL DNA模板，10μmol /L的正向、反向引物各0.4uL，PremixExTaq^TM        补充水至20μL。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，所述实时荧光定量PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述引物的碱基序列为：

正向引物：5’-ATCCACGTCACCACTTTCAA-3’；

反向引物：5’-TGCTTGGAGATCCACATTTG-3。