[发明专利]检测禾谷镰孢多菌灵抗性相关点突变E198K出现频率的引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种禾谷镰孢多菌灵抗性相关点突变E198K出现频率的检测引物及方法。 

背景技术

近年来，我国由于秸秆还田和气候因素的变化，禾谷镰孢（Fusarium graminearium）引起的小麦赤霉病常发区由长江中下游向北扩展到山东、河南、河北等黄淮小麦主产区，2010年全国发病面积超过1亿亩，部分地区收获的小麦中赤霉病菌毒素严重超标、损失惨重。因为缺乏高水平抗性的种质材料，目前生产上主要使用化学药剂多菌灵对小麦赤霉病进行防治。但由于该类药剂（苯并咪唑类）长期大量使用，导致浙江、江苏和安徽等地区已出现多菌灵抗性问题。 

β-微管蛋白的第6、50、167、198、200或240位发生点突变是导致大多数病原菌产生苯并咪唑类杀菌剂抗药性的主要原因。根据抗性指数（Resistant factor，RF），禾谷镰孢对多菌灵表现出低、中和高水平三类抗性，其中1≤RF<10为低抗，10≤RF<50为中抗，50≤RF<100为高抗。已有研究表明，β-微管蛋白上不同的点突变分别对应不同的抗性水平：E（GAG）198L（CTG）导致高水平抗性、F（TTT）167Y（TAT）、F（TTC）200Y（TAC）和E（GAG）198K（AAG）导致中水平抗性、E（GAG）198Q（CAG）导致低水平抗性。已有田间多菌灵抗性禾谷镰孢的研究报道了点突变F167Y、E198/Q/L和F200Y。2011年Qiu等人通过定点突变方法实验室获得了两个含有新点突变（Y50C和E198K）的多菌灵抗性菌株（Qiu et al.,2011,Pest Management Science,67:191-198）。本课题组在2012对田间收集的4320份赤霉病样品进行多菌灵抗性检测时，在江苏靖江麦区发现了含E198K点突变的抗性菌株，这说明田间禾谷镰孢种群中已出现了含该点突变的抗性菌株。 

针对该点突变E198K，公开号为CN101988122A的中国专利文献公开 了一种禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因型的分型检测方法，包括：提取待测菌株的核基因组DNA；运用三组引物对，进行PCR反应；根据PCR产物电泳图谱鉴定菌株对多菌灵抗性的基因型。在该专利中，公开了可采用Tetra-primer ARMS-PCR方法来定性检测该点突变，但是并不能定量地检测该点突变。 

因此，需要建立一种检测技术能定量检测该点突变并能准确检测含该点突变种群在田间的出现频率及变化动态，对病害的有效防治和农药的合理使用有指导意义，同时也为药剂筛选压力下，不同类型抗性群体动态变化的研究提供了基础。 

发明内容

本发明提供了一种检测禾谷镰孢多菌灵抗性相关E198K点突变出现频率的引物，特异性强。 

一种引物，碱基序列为： 

正向引物：5’-AGCTCGTCGAGAACTCTGAAA-3’； 

反向引物：5’-GCAGCGGCCATGATGTTCTT-3’。 

本发明还提供了一种检测禾谷镰孢多菌灵抗性相关点突变E198K出现频率的方法，其特征在于，包括： 

（1）采样，将样品混合后提取DNA； 

（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到混合样品中含E198K点突变的DNA的重量； 

（3）根据禾谷镰孢的actin基因设计引物，以所述的DNA作为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得到混合样品中总DNA的重量； 

（4）根据下述公式，计算得到多菌灵抗性相关点突变E198K的出现频率： 

FRE_E198K=Q_E198K/Q_Fg×100%； 

其中，FRE_E198K为多菌灵抗性相关点突变E198K的出现频率，Q_E198K为混合样品中含点突变E198K的DNA的重量，Q_Fg是混合样品中禾谷镰孢总DNA的重量。 

禾谷镰孢多菌灵抗性相关E198K点突变出现频率为禾谷镰孢E198K 突变种群的出现频率，为保证结果准确，采样时应按照生物统计学的方法进行。 

由于本申请是以DNA重量的比值来反映禾谷镰孢多菌灵抗性相关E198K点突变出现频率，因此，本领域人员可以理解，在提取DNA前进行样品混合时，不同样品的重量应尽量保持一致。