[发明专利]寡克隆肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种能够有效提取和扩增培养肝癌浸润淋巴细胞的方法及其在肝癌免疫治疗方面的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，而我国约占全球45%。目前，肝癌的治疗己从单一的手术切除发展到以手术为主的包括肝动脉化疗栓塞、外放射治疗、局部治疗以及免疫治疗等多模式的综合治疗阶段[1]。这些手段在有效杀伤肿瘤的同时，不可避免地给机体免疫功能带来不同程度的损伤。随着免疫学、分子生物学的飞速发展，继手术、放疗、化疗三大疗法之后，肿瘤的生物治疗己成为肿瘤治疗的第四种模式。肿瘤的生物治疗包括免疫治疗、基因治疗、干细胞治疗、诱导肿瘤细胞的分化及凋亡、抑制肿瘤新生血管治疗等，其中主要是免疫治疗[2]。肝癌病人免疫功能低下，特别是局部免疫微环境异常，导致机体免疫防御反应不能有效进行是肝癌产生免疫逃逸、容易转移复发的重要因素[3]。如何有效调节宿主免疫功能、改善肝脏局部免疫微环境以利机体抗瘤效应的发挥，是防治肝癌术后转移复发、消灭术后残瘤的重要、有效手段，是肝癌综合治疗的重要内容。

虽然肝癌免疫研究已取得了一定进展，但对究竟肝癌细胞是如何诱导免疫耐受并逃避免疫监视的确切机制尚未充分了解。在诱导激活抗原特异的T细胞反应的同时，必须重视肝脏局部免疫微环境对激活的T细胞的抑制作用。只有这样，才能有效激发抗肿瘤免疫，产生较好的抗瘤效果。因此运用免疫手段，提高机体本身的免疫功能成为治疗肿瘤新措施，使得HCC的免疫防治研究日趋重要[4]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是一群浸润于肿瘤组织中，对自体肿瘤细胞有较高特异性杀伤活性的淋巴细胞。因其与肿瘤细胞密切接触而被认为是宿主对肿瘤识别的直接而特异的表现，具有高效、特异、副作用小等优点，近年来受到国内外学者特别关注[5]。肿瘤组织中浸润淋巴细胞数量和功能的变化在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的强度和总体水平。然而，新鲜提取的TIL抗瘤活性十分低下，激活TIL进行过继免疫治疗，但临床治疗效果并不理想，研究显示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态[6]。在诱发阶段调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)诱导TIL发生免疫偏倚，有的则因Treg数量显著增多使TIL几无功能，使TIL的抗瘤免疫陷入困境[7]。

在以细胞免疫为主的肿瘤免疫过程中，Treg处于关键环节。1999年Sakaguchi等将除去了CD25⁺细胞的CD4单阳性T细胞过继转移给裸鼠，结果裸鼠发生多种自身免疫病，而将CD4⁺CD25⁺T细胞和CD4⁺单阳性T细胞共同过继转移，就不发生自身免疫病，证实CD4⁺CD25⁺T细胞能维持自身免疫耐受。随后体外研究也发现CD4⁺CD25⁺T细胞具有低反应性和免疫抑制功能，根据其功能将CD4⁺CD25⁺T细胞作为调节性T细胞[8]。它在肿瘤组织中的浸润程度代表了机体肿瘤免疫抑制反应的一个方面，在机体免疫调节中起重要作用，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。Jone等发现用抗CD25单克隆抗体去除Treg细胞可以抑制恶性黑色素瘤的生长；这给人类肿瘤治疗提供了新的免疫疗法[9]。Treg细胞联合其他提高肿瘤细胞免疫原性的方法可以提高肿瘤免疫。有研究小组也正在测试一种Treg细胞的阻滞剂，可以治疗恶性黑色素瘤[10]。鉴于Treg细胞在免疫学中的地位和作用，其研究和应用已成为最近肿瘤免疫和免疫治疗的热门方向，并已经取得了喜人的成绩。