[发明专利]单核细胞移动抑制因子的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽的合成方法，特别涉及单核细胞移动抑制因子的固相合成方法。

背景技术

缺血性脑血管病（缺血性脑卒中）是世界上发病率、死亡率、致残率最高的疾病之一，极大地威胁着人类、特别是老年人地健康和生活质量，已经成为全球社会医疗资源的巨大负担。目前国内外应用于治疗缺血性脑血管病地有效药物很少，研发新型药物用于缺血性脑血管病的防治具有重要意义。

中国专利（CN101361961）描述了单核细胞移动抑制因子（MLIF）及其剪接体能显著降低小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤面积，并显著改善小鼠脑缺血后的神经行为。单核细胞移动抑制因子（MLIF）为从溶组织内阿米巴的分泌液中提取的五肽，其氨基酸序列为Met-Gln-Cys-Asn-Ser。

MLIF的结构式见(Ⅰ)，通常会以盐的形式存在，可以是内盐(Ⅱ)式,或与酸组合成盐（Ⅲ）或与碱组合成盐（Ⅳ），具体如下列各式所示：

发明内容

本发明的目的在于提供了单核细胞移动抑制因子的固相合成方法，本发明提供的固相合成方法操作简单，合成周期短，成产成本低，减少了废液的产生，后处理容易，副产物少，产品收率高，利于五肽（Met-Gln-Cys-Asn-Ser）的大规模生产。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：单核细胞移动抑制因子的固相合成方法，含以下步骤：

A）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的丝氨酸叔丁酯（Fmoc-Ser(tBu)）偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂；

B）通过固相合成法，按照五肽（Met-Gln-Cys-Asn-Ser）主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且具侧链保护的氨基酸，其中天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺为侧链Trt保护；

C）脱除氨基酸侧链保护基；

D）裂解，脱除保护基和树脂得到五肽（Met-Gln-Cys-Asn-Ser）粗品；

F）纯化，冻干，得到五肽（Met-Gln-Cys-Asn-Ser）精制品。

优选的，所述活化剂系统由DCC、HOBT和DMAP组成。

树脂固相载体可以为常用的Fmoc化学用树脂，优选的为2-Cl-Trt树脂或王树脂。

进一步的，步骤B）还包括如下步骤：

B1)采用DBLK使所述Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Trt树脂脱除Fmoc保护基，得到Ser(tBu)-2-Cl-Trt树脂，所述DBLK由体积比为1:4-5的哌啶和DMF组成；

B2）在偶联剂系统的存在下，Ser(tBu)-2-Cl-Trt树脂和Fmoc保护且侧链Trt保护的天冬酰胺偶联得到Fmoc-Asn-Ser(tBu)-树脂；

B3）重复步骤B1、B2，按照五肽（Met-Gln-Cys-Asn-Ser）主链肽序依次进行氨基酸的偶联。

所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、DCC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOAt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。

作为本发明的进一步改进，也可以直接购买得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂，从而省略步骤A）；优选的，所述Fmoc-Ser(tBu)-树脂为取代值为0.4～1.0mmolNH/g的Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Trt树脂或取代值为0.2～0.9mmolNH/g的Fmoc-Ser(tBu)-王树脂。

进一步的，所述步骤F)中，纯化为反相色谱纯化，色谱柱为反相C₁₈柱，柱温为30～40℃。

本发明最终制备获得Met-Gln-Cys-Asn-Ser五肽，可以通过加入酸或碱的方式得到药理上允许的Met-Gln-Cys-Asn-Ser五肽的各式盐，如在任选的适宜溶剂中与三氟乙酸、乙酸或氢氧化钠进行反应，分别得到Met-Gln-Cys-Asn-Ser五肽的三氟乙酸盐、乙酸盐或钠盐等。

与现有技术相比，本发明提供的固相合成方法操作简单，合成周期短，成产成本低，减少了废液的产生，后处理容易，副产物少，产品收率高，利于五肽的大规模生产。

本发明中采用的部分缩略语相对应的化学名称如下：

Met：蛋氨酸

Gln：谷氨酰胺

Cys：半胱氨酸

Asn：天冬酰胺

Ser：丝氨酸

Boc：叔丁氧羰基