[发明专利]一种灵菌红素提取纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物中间体的提取工艺，尤其是一种从固态发酵物料中提取和纯化灵菌红素的方法。

背景技术

灵菌红素（prodigionsin）是一族天然红色素的总称，通常具有由三个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，属于生物碱。自然界中产灵菌红素的菌株主要是粘质沙雷氏菌（Serratia marcecens），此外还有一些放线菌（例如：Streptomyces coelicolor）、以及海洋细菌（例如：Hahella chejuensis、Pseudoalteromonas denitrificans）。

近年来，许多学者研究发现，灵菌红素家族化合物是一类非常有潜力的抗癌待选药物，对许多癌细胞（如肺癌、结肠癌、肾癌以及乳腺癌）都具有良好的细胞凋亡作用，而对正常细胞的毒性非常低；除了诱导细胞凋亡，灵菌红素能够抑制癌细胞的浸润转移作用。此外，灵菌红素可以抑制磷酸化反应、激活细胞酪氨酸激酶，并且通过与细胞表面受体结合，阻断γ链的信号转换，从而显示出免疫抑制活性。灵菌红素已经成为抗癌等新药研发的热点。

相对于普通硅胶柱层析，利用动态轴向压缩柱系统纯化灵菌红素，效率高，单针上样量大，分离纯化时间短；选择的溶剂可以使用分析级或者工业级试剂，价格低廉，更好的降低成本，有利于工业化生产。目前灵菌红素及其类似物的发酵主要以液态发酵为主，发酵水平较低，总体来说还不能满足工业化需求。由于灵菌红素主要为胞内产物，只有少量的分泌在发酵液中，因此，从发酵液中回收灵菌红素程序较为复杂，溶剂和能耗较高，这也是限制灵菌红素产业化的一个瓶颈。公开号为CN102002469A（发明名称：生产灵菌红素的菌株及其方法）、CN102277323A（发明名称：高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株及其应用）、CN101392227B（发明名称：一种粘质沙雷氏菌及其生产的灵菌红素）等专利文献公开了一系列粘质沙雷氏菌发酵生产灵菌红素的方法，并没有涉及灵菌红素的提取工艺。专利CN102311981A（发明名称：制备提纯灵菌红素的方法）、CN1884483A（发明名称：生产灵菌红素的海洋细菌菌株及其生产灵菌红素的方法）等专利文献公开了一系列液态发酵法生产、提取纯化灵菌红素的方法，并没有涉及固态发酵物料中灵菌红素的提取纯化工艺。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种从固态发酵物料中提取纯化灵菌红素的方法。为了实现这一目的，本发明采取了以下技术方案。

一种提取纯化灵菌红素的方法，用于从生产灵菌红素的固态发酵物料中分离并纯化出灵菌红素，其特征在于，具有以下步骤：将固态发酵物料进行真空干燥制得提取原料；以一定重量比将提取溶剂与提取原料在容器中混合，保持温度在40℃-50℃之间，浸提1-2小时，移出并过滤容器中的液体得到第一提取液，于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发，得到第一浓缩液；以一定重量比将含水溶剂加入容器，保持温度在40℃-50℃之间，浸提1-2小时，移出并过滤容器中的液体得到第二提取液，于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发，得到第二浓缩液；合并第一浓缩液和第二浓缩液，并于45℃-60℃减压浓缩至无液体挥发，制备得到灵菌红素浓缩液；将灵菌红素浓缩液离心，分别收集上清液和沉淀；向上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，60℃下减压浓缩，蒸干溶剂得到灵菌红素粗提物；将灵菌红素粗提物与沉淀合并，加入0.5～2倍质量的硅胶，充分搅拌后干燥，制备得到灵菌红素干浓缩物；将灵菌红素干浓缩物加入硅胶轴向压缩柱，以体积比1:1～1:4的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯梯度洗脱，收集并合并红色洗脱组分，减压浓缩蒸干溶剂得到灵菌红素次纯品；将灵菌红素次纯品与0.5～2倍质量的硅胶混合，继续用硅胶轴向压缩柱纯化，以体积比1:3～1:5的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯进行梯度洗脱，按时间分批收集洗脱组分，利用高效液相色谱检测各批洗脱组分，并将纯度高的洗脱组分合并，减压浓缩除去溶剂得到灵菌红素高纯品。

发明的作用与效果

本发明工艺简单，安全可靠，灵菌红素的提取率达到90%以上；与液态发酵提取技术相比，本方法提取溶剂消耗少，能耗低，提取损失小。采用动态轴向压缩柱系统纯化灵菌红素，产品分离效率高，溶剂消耗少，产品质量容易控制，纯化系统为密闭系统，操作环境污染小。

具体实施方式