[发明专利]用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及分子生物学、病毒学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明具体涉及一种用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法。检测与鉴定汉滩病毒核酸的样本包括感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者。它包括设计一对特异性扩增汉滩病毒的引物，通过制备标准品，研究和优化实验条件，对提取感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者血清的总RNA进行qRT-PCR特异性扩增检测。

背景技术

肾综合征出血热诊断与检测研究现状：

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种分节段的负链RNA病毒, 基因组由大（L）、中（M）、小（S）三个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、糖蛋白Gn和Gc和核衣壳蛋白。目前汉坦病毒属在世界范围内存在30个基因型，我国以汉滩（HTNV）和汉城（SEOV）型为主。汉坦病毒属病毒感染人主要可以引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），在我国主要引起以发热、出血和急性肾功能损害为特征的肾综合征出血热。该病是我国最为常见的自然疫源性疾病之一，危害十分严重。此外，汉滩病毒还是一种可被侵略者和恐怖分子所利用的生物战剂，已被列入国际《禁止生物武器公约》议定书核查清单，因此具有极其重要的意义。目前对该病毒所致疾病仍无特效的治疗药物，因此及时发现和诊断汉滩病毒感染显得尤为重要。早期诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键。

实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长，仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最终对初始模板进行定量。传统的PCR定量是一种终点法的检测，动态范围受限且检测重现性极差。实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测，具有灵敏度高，重复性好，动态范围宽，高通量等优点。实时荧光定量PCR技术主要分为荧光染料法和荧光探针法两种。

SYBR green I是一种能与dsDNA特异结合的染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green I荧光染料，可特异性地与dsDNA结合，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本，因此非常适合大规模样本的检测。

Taqman探针法是通过寡聚核苷酸探针与目的序列互补实现的。探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记荧光淬灭基团，当两个基团相互靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5′端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭基团发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因为只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测，同时可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列，因此探针法具有特异性高，可多通道检测的特点，但价格昂贵，不适合做大规模样本的检测。

对于汉滩病毒感染，目前常用的诊断方法主要是传统的免疫学方法，包括病毒的分离鉴定、ELISA法检测血清中抗HTNV IgM、IgG抗体、间接免疫荧光法（IFA法）检测病毒抗原和抗体以及核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经典的分离鉴定法费时，IFA法也不适用于快速的现场检测，检测HTNV抗体仅是一个侧面的间接指标，且均存在着特异性和敏感性不够高、不能准确定量等问题。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR）以其特异性强、灵敏度高、检测速度快、能准确定量等优点，逐渐成为分子生物学和医学研究等领域的重要工具，在病原的定性定量检测、基因表达水平分析等方面得到了广泛应用。

发明内容