[发明专利]一种快速检测美国白蛾的试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测美国白蛾的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的特异性引物COI01 /02或SpmR01/02试剂；所述的特异性引物COI01 /02与SpmR01/02序列如下：

COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，

COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，

SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，

SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。

2.根据权利要求1所述的快速检测美国白蛾的试剂盒，其特征在于，由1次用量以上的下列试剂组成：

Taq buffer，MgCl₂，dNTP mix，Taq DNA 聚合酶，特异性引物COI01 /02或SpmR01/02，ddH2O。

3.权利要求1所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）DNA的制备：采用GenMagBio 动物细胞组织/细胞基因组DNA 磁珠提取试剂盒提取待检测样品和美国白蛾标准对照样的DNA；

2）PCR反应体系与反应条件

50μL反应体系组成：5μL 10×Taq buffer、2 mmol/L MgCl₂、200 μmol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3μL DNA模板、特异性引物COI01 /02或SpmR01/02各1 μmol/L，ddH2O补齐；

反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性1 min、52℃复性30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存；

3）PCR结果判定

混合8 μLPCR产物与2 μL 6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min，0.5% μmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带，待检测样品也具有相同条带即为美国白蛾，否则不是美国白蛾。

4.根据权利要求3所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤1）中，DNA提取的具体过程如下：

直接剪取供试标本足和胸部30mg放入2mL试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏水冲洗浸泡4~5次，弃水；干标本无菌蒸馏水浸泡3h后吸干水分；置于2mL离心管，MM400球磨仪中震荡碾磨（30次/s）30s，加入180μL Lysis Buffer、20μL Proteinase K，震荡混匀，常温过夜，55℃震荡温浴3-5h，12000rpm离心10min，取上清，加入200μL Binding Buffer和200μL无水乙醇，充分混匀，加入20μL磁珠，轻柔颠倒混匀10min；离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer ? 500uL颠倒混匀2min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer Ⅱ同样洗涤两次，离心管仍置于磁力架上，缓慢加入Wash Buffer Ⅲ，1min后移走管内液体；加入20μL Elution Buffer，55℃水浴10min洗脱磁珠上吸附的DNA，4℃储存备用。