[发明专利]一种快速检测美国白蛾的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于美国白蛾检测技术领域，具体涉及一种快速检测美国白蛾的试剂盒。

背景技术

美国白蛾[Hyphantria cunea (Drury)]又名秋幕毛虫、秋幕蛾，属鳞翅目（Lepidortera）、灯蛾科（Arctiidae）、灯蛾亚科（Arctiinae），是世界著名的检疫性有害生物。原产于北美洲，分布于美国、加拿大、墨西哥等地区，1940年传入欧洲，1945年传入日本，1958年传入韩国，1979年传入我国辽宁丹东。目前，国内公布的疫区有北京、天津、河北、山东、辽宁、陕西、江苏等省市。国务院办公厅曾多次下发文件，要求大力加强美国白蛾查防治理工作。2007年美国白蛾被纳入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

在美国，美国白蛾有2个种，分别是黑头种和红头种，而我国主要分布的是黑头型。由于该虫繁殖力强大，传播途径广泛，寄主种类繁多，食性庞杂，食量巨大，生态适应性强，危害程度严重，是我国农、林、果、蔬业的重要害虫。据赵铁珍等人于2004年研究评估全国美国白蛾疫区的非经济损失（环境功能损失、景观美学损失、生产生活损失、心理影响损失、生态系内部失衡损失、区域声誉损失）合计为140.35亿元。所以说，准确的种类鉴定是防止美国白蛾侵入非疫区，保护非疫区生态环境的重要手段。

美国白蛾成幼虫与灯蛾科其他种类在形态上极难区分，尤其是口岸检疫时截获美国白蛾的卵或不完整的虫体，利用传统的形态分类更难做出快速准确的鉴定。因此需要开发出精准的美国白蛾检测方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速检测美国白蛾的试剂盒，使其具有准确稳定、操作方便、特异性强等特点，满足使用需求。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测美国白蛾的试剂盒，至少包括1次用量以上的特异性引物COI01 /02或SpmR01/02试剂；所述的特异性引物COI01 /02与SpmR01/02序列如下：

COI01序列：5'-CAGGAACTGGATGAACA-3'，

COI02序列：5'-CCTACTGCTCATACGAA-3'，

SpmR01序列：5'-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3'，

SpmR02序列：5'-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3'。

所述的快速检测美国白蛾的试剂盒，由1次用量以上的下列试剂组成：

Taq buffer，MgCl₂，dNTP mix，Taq DNA 聚合酶，特异性引物COI01 /02或SpmR01/02，ddH2O。

所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1）DNA的制备：采用GenMagBio 动物细胞组织/细胞基因组DNA 磁珠提取试剂盒提取待检测样品和美国白蛾标准对照样的DNA；

2）PCR反应体系与反应条件

50μL反应体系组成：5μL 10×Taq buffer、2 mmol/L MgCl₂、200 μmol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3μL DNA模板、特异性引物COI01 /02和/或SpmR01/02各1 μmol/L，ddH2O补齐；

反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性1 min、52℃复性30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存；

3）PCR结果判定

混合8 μLPCR产物与2 μL 6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min，0.5% μmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带，待检测样品也具有相同条带即为美国白蛾，否则不是美国白蛾。

步骤1）中，DNA提取的具体过程如下：