[发明专利]一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括扩增反应液、引物反应液、DNA聚合酶、S.suis2型阳性标准品、核酸染料、以及阴性对照品，其中扩增反应液包括10×Bst DNA聚合酶缓冲液，甜菜碱，dNTP混合物，Mgso₄和双蒸水；引物反应液包括CPS2J-F3引物、CPS2J-B3引物，CPS2J-FIP引物和CPS2J-BIP引物，所述的CPS2J-F3引物为SEQ ID NO：1，所述的CPS2J-B3引物为SEQ ID NO：2，所述的CPS2J-FIP引物为SEQ ID NO：3，所述CPS2J-BIP引物为SEQ ID NO：4；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述的S.suis2型阳性标准品为S.suis2型菌株基因组DNA；所述的核酸染料为核苷酸绿色胶体染料；所述的阴性对照品为ddH₂o。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述每20.0μL的扩增反应液由根据下组分组成为：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中Bst DNA Polymerase的浓度为8U/μl。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物反应液中含有10uMCPS2J-F3引物、10uM CPS2J-B3引物、40uM CPS2J-FIP引物和40uM CPS2J-BIP引物。

5.一种利用权利要求1所述试剂盒检测S.suis2型CPS2J基因的方法，其特征在于：所述的检测方法依次包括下列步骤：

(1)待检标本细菌DNA的提取：利用通用型核酸提取试剂提取待检标本细菌模板DNA；

(2)S.suis2型CPS2J基因的LAMP扩增：恒温条件下，利用试剂盒中引物反应液中的引物对S.suis2型的特异性荚膜多糖CPS2J基因进行LAMP扩增得到LAMP扩增产物；

(3)LAMP扩增产物的显色反应初筛：向含有步骤(2)获得的LAMP扩增产物的反应管内加入核苷酸绿色胶体染料染色1-5分钟，通过肉眼判断反应液的颜色，反应液变绿为阳性，反应液保持染料的棕色不变为阴性；

(4)扩增产物的电泳检测：将步骤(3)中显色反应为阳性的待检标本的LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现；

(5)S.suis2型链球菌阳性判断：步骤(4)电泳检测中出现小于100bp的梯状条带的待检标本含有S.suis2型链球菌。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)包括如下步骤：

(1)向标明编号的LAMP反应管中加入扩增反应液20.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板1μL和Bst DNA Polymerase1.0μL；

(2)将上述LAMP反应管混匀点离后置于恒温水箱内进行以下反应：①65℃60min，②80℃2min.反应完毕即可得到LAMP扩增产物。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述核苷酸绿色胶体染料的型号为核苷酸绿色胶体染料。

8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)包括如下步骤：取1.5ul扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中，80V电泳40min后放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现。

9.权利要求1所述的试剂盒在猪链球菌2型阳性检测中的应用。

10.权利要求5所述的检测方法在猪链球菌2型阳性检测中的应用。