[发明专利]一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测病源微生物的试剂盒及其应用，具体涉及一种通过等温核酸扩增方法检测猪链球菌2型核酸的试剂盒及其在猪链球菌2型核酸检测中的应用，属于病源微生物检测领域。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)2型是一种致病力强的重要人兽共患病病原体，可引起猪和人感染发病，并可导致死亡。1998年，江苏省南通市爆发了猪群S.suis2型疫情，并在国内首次报道了人感染S.suis2型病例，近年来国内已多次发生人感染S.suis2型疫情，S.suis2型疫情成为了一个重要的公共卫生问题。

现有的猪链球菌检测方法有微生物学方法、血清学鉴定及PCR检测等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。链球菌在显微镜下呈圆形或卵圆形，直径小于0.2μm，常成双排列或成链状。革兰氏染色阳性，除D群个别细菌外，均无鞭毛，多数有荚膜。血琼脂平板上可长成直径0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落，多数致病菌株具有溶血能力，溶血环的大小和类型因菌株而异。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验，其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性，应用越来越广泛，但其敏感性和特异性仍有很大提高空间。

环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，英文名称为loop-mediated isothermal amplification,是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。Notomi报道了一种名为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的新型核酸扩增方法，该方法利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增，LAMP反应需要特别设计2条内引物(FIP和BIP)和2条外引物(F3和B3)，靶DNA在60℃到65℃恒温条件下(如水浴锅内)保温约60分钟，LAMP扩增结果即可判定。LAMP最终产物是由大量菜花样结构组成的茎环状DNA混合物，由于LAMP扩增产生了巨大数量的DNA产物，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光来对产物进行检测。

CN1896279A公开了一种PCR法检测猪链球菌2型的方法，其中同时使用了3对引物进行PCR扩增，该方法只能在菌浓度为450个/ml以上时具有阳性结果。

CN102605046A公开了一种试剂盒和检测猪链球菌2型的方法，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修饰；所述探针的5’端和/或3’端被地高辛修饰；所述探针能够与所述双链DNA扩增产物中带有生物素修饰的单链DNA杂交，该方法特异性较强，但该方法操作复杂、检测耗费时间长，且其灵敏度具有很大的改进空间。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种快速方便、特异性强、灵敏度高的基于LAMP的猪链球菌2型(S.suis2型)核酸检测试剂盒，并提供一种使用该种试剂盒快速检测S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因的方法，从而为猪链球菌的监测和临床诊断提供一种有益的检测手段。

本发明所述的试剂盒包括扩增反应液、引物反应液、DNA聚合酶、S.suis2型阳性标准品、核酸染料以及阴性对照品，其中扩增反应液包括10×Bst DNA聚合酶缓冲液(10×Bst DNA Polymerase Buffer)，甜菜碱(Betaine)，dNTP混合物(dNTP Mixture)，Mgso₄和双蒸水(ddH₂o)；引物反应液包括CPS2J-F3引物、CPS2J-B3引物，CPS2J-FIP引物、CPS2J-BIP引物；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)；所述的S.suis2型阳性标准品为S.suis2型菌株基因组DNA；所述的核酸染料为核苷酸绿色胶体染料；所述的阴性对照品为ddH₂o。