[发明专利]溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNA及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201310364591.6 | 申请日： | 2013-08-20 |
| 公开（公告）号： | CN103451198A | 公开（公告）日： | 2013-12-18 |
| 发明（设计）人： | 李曦;柴政;符芳 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/45 | 分类号： | C12N15/45;C12N15/63;C12N15/86 |
| 代理公司： | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人： | 孙皓晨;韩小雷 |
| 地址： | 150001 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 溶瘤型 新城 疫病 d90 全长 感染性 cdna 及其 构建 方法 应用 | ||
1.溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA，其特征在于：所述的全长感染性cDNA序列为SEQ ID NO:2所示。
2.一种构建权利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的方法，包括：
1）以新城疫病毒D90株的RNA为模板，分11段扩增D90株基因组，进行全基因组序列测定，得到的新城疫D90株病毒的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示；
2）通过RT-PCR方法获得新城疫病毒D90株基因组各部分的4个片段，将所扩增的PCR片段采用同源重组的方法组装克隆到质粒载体中，构建带有溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA的质粒载体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的全长感染性cDNA的序列如SEQ ID NO:2所示，与SEQ ID NO:1所示的亲本新城疫D90株天然序列相比，其缺失掉一个KpnI酶切位点。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的质粒载体为加入T7启动子、核酶和T7终止子的pBR322载体。
5.一种溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统，其特征在于：该溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统包括包含权利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的质粒载体和三个辅助质粒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pCI-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
6.如权利要求5所述的反向遗传操作系统，其特征在于：溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:5所示。
7.权利要求1所述的全长感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的应用，其特征在于包括将所述的全长感染性cDNA和三个辅助质粒共转染哺乳动物细胞，拯救得到新城疫病毒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pCI-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:5所示。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
10.权利要求5或6所述的反向遗传操作系统在拯救新城疫病毒中的应用。
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