[发明专利]溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNA及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及单股负链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及具有溶瘤功能的新城疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用，本发明由该新城疫病毒感染性cDNA、微基因组及其辅助质粒所组成的新城疫病毒反向遗传操作系统。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV）属副粘病毒科禽腮腺炎病毒属的成员，为单股负链RNA病毒，其基因组RNA全长约15kb。RNA基因组在3'末端为55个核苷酸的前导序列，5′末端为114个核苷酸的尾随序列，这两个序列对病毒的转录和复制都至关重要。病毒的六个基因RNA的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。新城疫病毒的这六个基因编码主要的六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphate protein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin Neuraminidase protein,HN)和RNA聚合酶(Large RNA-dependent RNA polymerase protein,L)。P基因的RNA编辑产生另外两个非结构蛋白V和W(Mebatsion et al.,2001;Steward et al.,1993)。病毒基因组RNA和NP、P、L共同形成核糖核蛋白复合体（RNP），RNP能够作为RNA转录和复制的模板，是病毒具有功能活性的最小感染单位(Hamaguchi et al.,1983)。

肿瘤治疗的最终目的是在对健康细胞不产生明显损伤的条件下清除癌症细胞。多种溶瘤型病毒已经被鉴定和并对其潜在的抗肿瘤功能、特异性、效果和安全性进行检测。在众多溶瘤病毒中，新城疫病毒已经被认为是有希望的溶瘤制剂被作为实验治疗应用于临床已40余年。一些临床试验表明NDV是安全有效的治疗制剂。新城疫病毒现已成为临床评估作为溶瘤、基因及免疫刺激治疗载体的五种病毒之一，极具开发价值。

反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因缺失、基因插入、基因替换和基因互补（构建嵌合病毒）等改造，以解决对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们在分子水平上研究病毒基因的功能及其具有的生物学特性的分子机制。

研究表明，新城疫病毒溶瘤株73-T可以杀死多种人癌症细胞。在裸鼠模型中，肿瘤内注射73-T能明显抑制多种异种移植的肿瘤，包括纤维肉瘤和神经胶质瘤。溶瘤型MTH-68株能明显部分或全部抑制癌细胞转移型肿瘤。一期临床试验表明，溶瘤新城疫PV701株具有广谱的抗肿瘤功能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有溶瘤作用的新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA。

所述溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA克隆与亲本新城疫D90株天然序列（SEQ ID NO:1所示）相比，缺失掉一个KpnI酶切位点，仅具有单一KpnI酶切位点是全长感染性cDNA克隆的分子标签。

本发明的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA，其特征在于：所述的全长感染性cDNA序列为SEQ ID NO:2所示。

本发明的目的之二在于提供一种构建所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA的方法，包括：

1）以新城疫病毒D90株的RNA为模板，分11段扩增D90株基因组，进行全基因组序列测定，得到的新城疫D90株病毒的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示；

2）通过RT-PCR方法获得新城疫病毒D90株基因组各部分的4个片段，将所扩增的PCR片段采用同源重组的方法组装克隆到质粒载体中，构建带有溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA的质粒载体。

其中所述的新城疫病毒D90株（新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作用，符芳等，《中国预防兽医学报》，2007年02期）由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。

在本发明中，优选的，所述的全长感染性cDNA的序列如SEQ ID NO:2所示，与SEQ ID NO:1所示的亲本新城疫D90株天然序列相比，其缺失掉一个KpnI酶切位点。