[发明专利]用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用

权利要求书

1.一种用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针，序列如下：

革兰阴性细菌探针：ACAGCCATGCAGCA

革兰阳性细菌探针：ACAACCATGCACCA。

2.一种使用权利要求1所述探针快速检测细菌的方法，包括以下具体步骤：

1)、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记：

用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下：

引物1：GATGCAACGCGAAGAACCTTAC

引物2：TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC

革兰阴性细菌探针：ACAGCCATGCAGCA

革兰阳性细菌探针：ACAACCATGCACCA

MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX；

2)、所设计的通用引物细菌特异性和通用性验证

提取各种细菌和非细菌病原微生物以及人基因组DNA，用步骤1中的引物，按照以下实验步骤进行通用引物的特异性和通用性验证：

(1)菌株复活

挑取适量微生物室冰冻保存的菌株，按五区划线接种于营养琼脂平板；流感嗜血杆菌接种于巧克力平板，CO₂培养箱过夜培养获得菌落；

(2)菌株DNA提取

用无菌环分别刮取平板上的1个菌落置于1ml无菌离心管中，充分混匀后，离心，弃上清，取50ul菌株液加等量的细菌提取裂解液，100℃煮沸10min，12000r／min离心5min，取上清液做PCR模板；

(3)反应体系

反应总体积50ul，10uM引物各2ul，25mM镁离子7ul，10mM dNTP4ul，1U的Taq酶，buffer5ul，模板5ul；

(4)扩增条件

94℃预变性5min，94℃变性40sec，退火30sec，72℃延伸1min，72℃后延伸5min，循环33次；

(5)扩增产物电泳分析

2％琼脂糖熔胶后加入2ul溴乙锭，灌胶后，取8.5ul扩增产物加1.5ul溴酚兰后上样，75伏特电泳50min，用凝胶成像系统观察结果；

3)、用通过验证的引物和标记探针，构建并优化MGB探针双色实时荧光PCR反应体系，扩增条件如下：

反应总体积25ul，10uM引物各1.0ul，10uM G-Probe和G+Probe各0.5ul，模板2.5ul，2.5×RealMasterMix10ul，20×Probe Enhancer Solution1.25ul，超纯水补足，扩增条件为：94℃预变性2min，94℃20sec、60℃60sec为一个循环，共40个循环。