[发明专利]用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用

说明书

背景技术

传统微生物培养与鉴定方法有以下局限性：鉴定时间过长，病原微生物的分离培养成功率不高，即鉴定的假阴性率较高，对于生长缓慢的微生物、苛养菌等难培养微生物，培养的敏感性很差，多种病原菌共同存在时，尤其是同时存在厌氧菌时，容易出现病原菌的漏检。因此，目前急需简便、快速、有效、相对价廉的病原微生物快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一组用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用，本发明可以简便、快速检测细菌，检测灵敏度较高，且检测费用相对较低。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针，序列如下：

革兰阴性细菌探针：5’ACAGCCATGCAGCA3’  14碱基对，

革兰阳性细菌探针：5’ACAACCATGCACCA3’  14碱基对。

一种使用所述探针快速检测细菌的方法，包括以下具体步骤：

1、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记：

用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下：

引物1：5’GATGCAACGCGAAGAACCTTAC3’  22碱基对

引物2：5’TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC3’  22碱基对

革兰阴性细菌探针：5’ACAGCCATGCAGCA3’  14碱基对

革兰阳性细菌探针：5’ACAACCATGCACCA3’  14碱基对

MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX；

2、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针对临床病原菌的覆盖范围是：40种革兰阴性细菌和21种革兰阳性细菌，见表1；

表161种临床病原性细菌

3、引物特异性和构建方法性能确认所用菌株和其他来源DNA：包括11种标准菌株、临床分离的19种菌株，3种非细菌性病原体和人源基因组DNA，见表2，

表2  30种细菌和3种非细菌性病原体

4、所设计的通用引物细菌特异性和通用性验证

提取表2中各种细菌和非细菌病原微生物以及人基因组DNA，用步骤1中的引物，按照以下实验步骤进行通用引物的特异性和通用性验证：

(1)菌株复活

挑取适量微生物室冰冻保存的菌株，按五区划线接种于营养琼脂平板；流感嗜血杆菌接种于巧克力平板。CO₂培养箱过夜培养获得菌落。

(2)菌株DNA提取

用无菌环分别刮取平板上的1个菌落置于1ml无菌离心管中，充分混匀后，离心，弃上清，取50ul菌株液加等量的细菌提取裂解液，100℃煮沸10min，12000r／min离心5min，取上清液做PCR模板。

(3)反应体系

反应总体积50ul，10uM引物各2ul，25mM镁离子7ul，10mM dNTP4ul，1U的Taq酶，buffer5ul，模板5ul。

(4)扩增条件

94℃预变性5min，94℃变性40sec，退火30sec，72℃延伸1min，72℃后延伸5min，循环33次。

(5)扩增产物电泳分析

2％琼脂糖熔胶后加入2ul溴乙锭，灌胶后，取8.5ul扩增产物加1.5ul溴酚兰后上样，75伏特电泳50min，用凝胶成像系统观察结果。

(6)得到PCR扩增产物电泳图显示所设计的引物对9种标准菌株和19种临床分离菌株有扩增产物出现，产物片段与设计相符；对病毒、真菌、人基因组DNA以及空白对照没有扩增产物；图1显示部分菌株的PCR扩增产物电泳图。

5、用通过验证的引物和标记探针，构建并优化MGB探针双色实时荧光PCR反应体系，扩增条件如下：

反应总体积25ul，10uM引物各1.0ul，10uM G-Probe和G+Probe各0.5ul，模板2.5ul，2.5×RealMasterMix10ul，20×Probe Enhancer Solution1.25ul，超纯水补足。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃20sec、60℃60sec为一个循环，共40个循环；并检测细菌以及分析革兰阳性和阴性菌分类特异性。