[发明专利]一种有机无机杂化微球颗粒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及富集糖蛋白，具体地说是一种单分散有机无机杂化核壳结构微球颗粒及其制备和在糖蛋白富集中的应用。

背景技术

众所周知，蛋白质的组成在生物体内是极其复杂并且不断变化，即使在相同物种的不同细胞或是相同细胞的不同时期，蛋白质的组成都存在显著差异，因此，蛋白质组学逐渐成为大家关注的焦点。在蛋白质组学中，糖蛋白作为一类重要的翻译后修饰蛋白，在信号转导、免疫及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的发现与鉴定在疾病的诊断和蛋白质组学领域意义重大。目前，用于N连接糖肽富集的主要方法有凝集素、酰肼、亲水作用色谱、硼酸亲和色谱等。对于具有1,2-顺式二醇化学结构的糖型，苯硼酸可以与其形成可逆的五元或者六元环的酯。此方法步骤简便快捷，避免了糖链结构的破坏，且富集产物与质谱兼容，对于研究糖蛋白糖基化位点信息及糖型结构归属较为方便。因此，苯硼酸在糖肽和糖蛋白的选择性富集领域受到了人们的关注。

目前，在利用苯硼酸功能化基团对糖蛋白富集的材料中，使用较为广泛的是氨基苯硼酸和硫基苯硼酸。目前主要是利用这些功能分子上的氨基和硫基与基质材料上的基团反应，将苯硼酸功能化基团接枝在基质材料的表面（X Zhang,X He,L Chen,Y Zhang,J.Mater.Chem.2012,22,1652016526;L Liang,Z Liu,Chem.Commun.2011,47,(8),2255-2257）。然而，这些固定化方法通常要求严格的反应条件（如无水溶剂，较高的反应温度等）制备步骤多，反应效率低，功能基团之间要求为交叉的反应。因此，需要寻找一种反应条件温和，选择性高反应条件与水环境兼容的新方法。点击化学具有反应产率高、官能基团稳定以及反应活性高的特点使其在制备功能材料的研究中受到各国学者的关注。X Zhang,X He,L Chen,Y Zhang,J.Mater.Chem.,2012,22,16520报道了一种在磁性Fe₃O₄微球表面修饰苯硼酸制备方法，该方法通过“点击化学”方法将含有叠氮基团的苯硼酸固定到磁性Fe₃O₄微球表面，有效提高了苯硼酸的固定化率，显著提高了其对糖蛋白的富集能力，但是该技术属于金属催化的叠氮化物与炔基的反应，且该材料的制备并没有使得材料亲水性同时得到改善。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种硫醇-烯点击化学功能化苯硼酸和亲水性改性同时进行的制备方法，该方法具有反应条件温和，选择性高反应条件与水环境兼容的特点，得到的产物颗粒形状规整，单分散性好，表面亲水性强。利用该聚合物材料作为富集材料，对糖蛋白的分离富集以及可以兼容后续的MALDI-TOF/MS直接分析，从而解决了样品的分析困难。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

步骤一：在反应容器中加入反应溶液甲苯，加入活化后的硅胶颗粒、含有硫醇基团的硅烷化试剂等，超声1分钟，使得加入的试剂以及硅胶颗粒均匀的分散在溶剂中，在烧瓶上接冷凝管，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，加热回流6-30h，之后停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用3000-10000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

步骤二：在烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂或者混合溶液，加入步骤一中得到的硅烷化修饰后的硅胶颗粒、3-丙烯酰胺基苯硼酸、多烯类功能单体、引发剂、链转移试剂等，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解均匀的分散在溶液中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至60-140℃。维持60-80℃条件下反应4-48小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用3000-10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶剂洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

在步骤一中，所说的含有巯基的硅烷化试剂为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，3-巯丙基三乙氧基硅烷。含有硅胶颗粒，硅烷化试剂的溶液中，硅胶颗粒占总质量的0.01-0.2wt%单体的总摩尔数浓度为0.05-1mol/L，余量为反应溶剂。修饰后的微球颗粒，其粒径为100nm-10μm。