[发明专利]一种制备间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于： 

（1）脐带预处理 

取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃～12℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%～75%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至0.5～2mm³，得到脐带组织小块，冷藏于0～5℃中； 

（2）脐带组织块冻存处理 

取出冷藏于0～5℃中的脐带组织小块，放入冷藏于0～5℃中的组织冻存保护液内，脐带组织小块与组织冻存保护液的质量与体积的比为0.5～1.5:0.5～1.5，得到组织块悬液，分装组织块悬液至冻存管中，将冻存管放置在冻存盒内，在0～5℃冷藏20分钟～40分钟，在零下80℃冻存4小时～6小时，最后放入零下196℃保存； 

（3）脐带组织块复苏处理 

取出零下196℃冻存的脐带组织冻存管，投入37℃～40℃的温水中，解冻后，在百级超净台上将组织块悬液移至离心管中，加入3～6倍组织块悬液体积的生理盐水冲洗，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体；离心管中加入生理盐水，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟，去掉液体，反复操作1～2次，去掉液体，保留组织块固体； 

（4）分离原代间充质干细胞 

方法一（组织块贴壁法）：将步骤（3）组织块固体接种至细胞培养瓶中，每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体，培养瓶放置在37℃、5%二氧化碳、饱 和湿度的细胞培养箱中静置3～5小时，向培养瓶内加入培养液，放置在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养8～12天，取出培养瓶中组织块固体，弃去；细胞培养瓶中再加入培养液，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养3～5天后，吸弃培养瓶中培养液，用pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，吸弃洗涤液，加入0.125%～0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3分钟，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液，转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，去掉液体，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞； 

方法二（酶消化法）：向步骤（3）组织块固体内加入其3～5倍体积的0.05%～0.2%Ⅱ型胶原酶消化液，放入37℃恒温摇床内震荡消化，100转/分钟～150转/分钟，1～3小时；将消化液用100μm细胞筛网过滤，再将过滤液离心，2000转/分钟～2500转/分钟，离心15分钟～20分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1500转/分钟～2000转/分钟，离心10分钟～15分钟，吸弃上清液，保留沉淀；加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml重悬沉淀，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代间充质干细胞； 

（5）扩增间充质干细胞 

取原代间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）反复浸洗培养瓶底壁贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%～0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1～3ml，静置消化1～3min，加入与消化液等体积的胎牛血清（FBS）终止细胞消化 作用，再加入pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml～40ml，即得间充质干细胞悬液；转移细胞悬液至50ml离心管内，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟；吸弃上清液，沉淀加入15～30ml培养液重悬，分装细胞悬液至3个～5个细胞培养瓶，各瓶补加10～20ml培养液。待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增间充质干细胞。 

2.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中组织冻存保护液为DMEM/F12、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）混合液，其中DMEM/F12:胎牛血清:二甲基亚砜的体积比为5:4:1。