[发明专利]一种制备间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及制备间充质干细胞的方法。 

背景技术

随着干细胞研究的兴起，特别是对成体干细胞的深入研究，使得体外分离培养不同组织来源的干细胞并建立相应的细胞系成为可能。其中，有关间充质干细胞的体内分布、体外分离、培养、诱导分化、发育潜能等的研究已经取得了突破性进展。由于间充质干细胞在成体组织中分布广泛，易于获取，并且可以在体外模拟体内的条件下大量扩增培养，最重要的是其诸多的临床应用潜能已被证实，例如在组织工程创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中必不可少，而且在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。因此，间充质干细胞已成为一种生物医学工程领域的“明星细胞”，引起越来越多的科学家、新闻工作者、普通民众等人群的强烈关注。 

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要来源于胚胎发育早期的中胚层，其具有自我更新、多向分化和调节免疫等特点。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育的多种组织中，用的最多的也是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的增加，干细胞数量及其增殖分化能力显著降低；取材时对患者有损伤；有骨髓疾病时无法采集；即使是健康供者，亦不能抽取过多的骨髓。这些缺点都限制了骨髓来源间充质干细胞的应用。 

近年来，也有研究者提出从新生儿脐带血里分离提取间充质干细胞，并且证实脐带血来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的生物学 特性、免役表型、分化潜能等。但脐带血来源的间充质干细胞分离效率较低，难以在细胞治疗及组织工程领域广泛应用。也有报道从胎儿的肝脏、肾脏、肺脏等部位分离提取间充质干细胞，但是来源于胎儿的间充质干细胞在临床应用时显然受到伦理道德及传统观念的限制。因此，寻找一种简单易行而且没有伦理道德限制的间充质干细胞来源已成为当务之急。 

各项研究显示，新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞，其生物学特性与骨髓来源的间充质干细胞相似，并且从脐带中分离得到的间充质干细胞免疫原性低、增殖能力更强。脐带是胎儿娩出后的附属产物，往往作为废弃物丢掉或烧毁。脐带采集过程简单，且采集时对胎儿及产妇没有任何损伤。这些优点足以令新生儿脐带成为间充质干细胞最理想的来源。 

虽然新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞已被证实，但是从脐带中分离得到的间充质干细胞在体外长期培养时也会发生不同程度的分化，其长期培养并维持未分化状态的操作技术并不成熟。因此保存新生儿脐带组织内最原始的间充质干细胞并在有需要时进行分离制备初代间充质干细胞更符合生物医药、科学研究、临床应用等领域的使用需求。 

发明内容

基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，通过长期的研究，确定了一种新的间充质干细胞的制备方法：以新生儿的脐带为原料，通过脐带预处理、冻存组织、复苏组织、分离原代间充质干细胞、扩增间充质干细胞的方法，该方法具有工业化简单、易于操作等优点，利用本发明方法可以大量冻存脐带组织，在临床有需要时对组织复苏以制备间充质干细胞，与现行的直接分离出间充质干细胞并进行细胞冻存相比，本方法可以充分保存脐带组织内最原始的间充质干细胞，既可大步降低保存成本，又可避免间充质干细胞在体外经多次传 代导致其分化而影响其临床应用。 

本发明通过下述技术方案实现的。 

一种新的间充质干细胞的制备方法： 

（1）脐带预处理 

取新生儿新鲜脐带，结扎脐带两端，放入含有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液100ml中，在4℃～12℃运输；在百级超净台取出脐带，用70%～75%医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至0.5～2mm³，得到脐带组织小块，冷藏于0～5℃中； 

（2）脐带组织块冻存处理 

取出冷藏于0～5℃中的脐带组织小块，放入冷藏于0～5℃中的组织冻存保护液内，脐带组织小块与组织冻存保护液的质量与体积的比为0.5～1.5:0.5～1.5，得到组织块悬液，分装组织块悬液至冻存管中，将冻存管放置在冻存盒内，在0～5℃冷藏20分钟～40分钟，在零下80℃冻存4小时～6小时，最后放入零下196℃保存； 

（3）脐带组织块复苏处理