[发明专利]用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法

权利要求书

1.用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）从嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的基因组GenBank Accession Number为CP002901，克隆硫氧化还原酶基因sor，在基因组中的标签为0405，硫氧化还原酶氨基酸序列为：

MPVPYIAVNKARVLNAPSSFETFTSVGPKVCMVTANHEGFVGFQNHVQVGVFPMGGRYG AAKMDMHEELNPIGIVQYTMWRHWEDHEAMHYENFDSIFRLCSQCLNMVVEGPWEPLYE IVAHDLPENVSMTDVPAALGAAWMAGQPVPAVSLPYGQRIVAASDHTVIPGREKDFEQAI VDVMTAFKKAPGFLGYMVMKQIGASAIGAMQLTPQGIHQALQTRGDNPPRDKEGNFQPM QAHSSPQEYVVHMEWADMNSAMMGISRVVVNHKMRMIHDRVLETVLKGPYVTLWNPIM EDTSWREYLHS；

将获得的硫氧化还原酶基因sor克隆到表达载体pTrc99A中构建质粒pTrc99A-sor；所述嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY已于2010年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2010203；

2）从质粒pEx18Tc克隆接合转移元件oriT连入pTrc99A-sor构建表达载体pTrc99A-sor-oriT，将构建好的重组质粒pTrc99A-sor-oriT转化至大肠杆菌S17-1(E.coli S17-1)中,以构建供体菌E.coli S17-1(pTrc99A-sor-oriT)；

3）37℃下将供体菌和嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY在接合培养基上共培养，将质粒pTrc99A-sor-oriT接合转移到嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY中，利用氨苄青霉素筛选工程菌嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR，将该工程菌在以Fe₂SO₄为能源的SA液体培养基中50℃振荡培养至对数期，利用Western Blot检测目的蛋白SOR的表达情况。

2.如权利要求1所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于在步骤2）中，所述oriT元件来源于质粒pEx18Tc。

3.如权利要求1所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于在步骤2）中，所述将构建好的重组质粒pTrc99A-sor-oriT转化至大肠杆菌S17-1(E.coli S17-1)中的方法采用氯化钙法。

4.如权利要求1所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于在步骤3）中，所述工程菌嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY-SOR已于2013年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013254。

5.如权利要求1所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于在步骤3）中，所述接合培养基由以下A部分、B部分和C部分组成，所述A部分为Na₂S₂O₃·5H₂O（1～5）g溶于20mL蒸馏水；所述B部分为(NH₄)₂SO₄（4～8）g、KCl（0.1～0.5）g、MgSO₄·7H₂O（0.7～1.5）g、酵母粉（0.5～3）g溶于500mL蒸馏水中，后用H₂SO₄将pH值调节至4.8；所述Ｃ部分为（8～15）g Sigma公司生产的Gum溶于480mL蒸馏水；A部分过滤除菌，B部分与C部分121℃高温高压灭菌20min，待B部分与C部分冷却到80℃左右时，将A部分、B部分和C部分混合，即得接合培养基。

6.如权利要求1所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，其特征在于在步骤3）中，所述以Fe₂SO₄为能源的SA液体培养基的组成如下：(NH₄)₂SO₄3.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、K₂HPO₄0.5g、KCl0.1g、Ca(NO₃)₂0.01g、酵母提取物0.2g、蒸馏水1L，使用H₂SO₄调节pH至1.8，121℃高温高压灭菌，再加入FeSO₄·7H₂O，采用0.22μM滤膜过滤除菌，使其终浓度为13.9g/L，pH调至1.8。