[发明专利]用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及嗜酸硫化芽孢杆菌，尤其是涉及用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法。

背景技术

微生物浸矿是指借助某些微生物的催化作用，使矿石中金属溶解的湿法冶金过程，它特别适合于处理贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出，具有设备简单、操作方便、成本低、环境友好等优点。

根据生长的最适温度范围的不同可将常见浸矿微生物分为三种，即嗜中温细菌(Mesophiles)、中等嗜热细菌(Moderate thermophiles)和极端嗜热细菌(Extreme thermophiles)。

中等嗜热细菌最适生长温度为45～50℃，由于有坚固的细胞壁，因此能耐受较高的矿浆浓度。研究表明，硫化芽孢杆菌属(Sulfobacillus)能在较高温度下氧化Fe²⁺和硫化矿自养生长，有坚固的细胞壁，能耐受较高的矿浆浓度和较高浓度的金属离子，因此该菌属在从硫化矿提取金属特别是从难选冶金矿回收金属方面展现了潜在的应用前景([1]Golovacheva RS,karavailo GI.Sulfobacillus-a new genus of spore-forming thermophilic bacteria.Microbiology,1979,48:658-665;[2]Norris PR,Marsh RM,Lindstrom EB.Growth of mesophilic and thermophilic acidophilie bacteria on sulfur and tetrathionate.Biotechnol.Appl.Bioc.,1986,8:318-329.)。

生物浸矿微生物具有生长缓慢、难以在固体平板上培养等特点，因此对它们的遗传操作十分困难，导致对这类微生物的分子生物学研究一直处于比较落后的局面。一些嗜酸氧化亚铁流杆菌(A.ferrooxidans)的基因在大肠杆菌(E.coli)里进行了异源克隆表达。但是受制于分子操作系统的局限，在浸矿微生物里同源表达基因或进行基因敲除的报道寥寥无几。电转化和接合转移是是比较常用基因转化方法。1992年，Kusano等人([3]Kusano T,Sugawara K,Inoue C,Takeshima T,Numata M,Shiratori T.Electrotransformation of Thiobacillus ferrooxidam with Plasmids Containing a mer Determinant.J.Bacteriol.,1992,174(20):6617-6623.)尝试用电转化的方法将质粒转移到A.ferrooxidans中，但在被检测的30株转化子菌株中只有一株获得成功，并且转化效率极低。因此，在此后的几个成功报道的转化案例中都是使用接合转移的方法进行的。1994年，彭基斌等([4]Peng JB,Yan WM,Bao XZ.Plasmid and transposon transfer to Thiobacillus ferrooxidans.J.Bacteriol.,1994,176:2892-2897.)首次在大肠杆菌(E.coli)和嗜酸氧化亚铁流杆菌(A.ferrooxidans)之间建立了接合转移系统，将外源质粒成功转入。基于这个系统，他([5]Peng JB,Yan WM,Bao XZ.Expression of Heterogenous Arsenic Resistance Genes in the Obligately Autotrophic Biomining Bacterium Thiobacillus ferrooxidans.Appl.Environ.Microb.,1994,60(7):2653-2656.)又成功实现了异源抗砷基因在A.ferrooxidans中的表达并提高了A.ferrooxidans的抗砷能力，获得了高效浸矿工程菌。2011年，Liu Wei等人([6]Liu W,Lin JQ,Pang X,Cui S,Mi S,Lin JQ.Overexpression of Rusticyanin in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859Increased Fe(II)Oxidation Activity.Curr.Microbiol.,2011,62:320-324.)以pJRD215质粒为载体，利用E.coli SM10的接合转移作用将A.ferrooxidans ATCC19859的铜蓝蛋白基因在其自身进行同源表达，获得Fe²⁺离子氧化活性增强的浸矿突变菌株。