[发明专利]一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子生态学技术领域，具体涉及一种PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物的筛选方法，特别是一种适合于所研究微生物生态体系菌群多样性解析的PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物的筛选方法。

背景技术

PCR-DGGE简称DGGE即变性梯度凝胶电泳、PCR-TGGE简称TGGE即温度梯度凝胶电泳和PCR-SSCP简称SSCP即单链构态多样性分析是三项DNA指纹技术，目前均已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。这三项技术可以用于分离长度相同但序列不同的DNA片段：对于DGGE和TGGE技术，双链DNA片段的分离是依靠其在含有化学变性剂梯度（DGGE）或温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为而实现的；对于SSCP技术，单链片段的分离是依靠其在低温下具有不同的构像而实现的。与微生物学传统研究手段相比，这三项微生物分子生态学技术最大的特点在于它们是不基于培养的方法——是以样品总DNA或RNA出发进行研究的，因此能检测到生态体系中大量的不可培养微生物。同时这三技术还具有可靠性强、重现性高、方便快捷的优点，目前被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、湖泊等各种环境的微生物生态解析中。

PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物的选择对于特定微生物生态中菌群多样性的研究十分关键：如果引物和研究体系中某些微生物种群不匹配，结果就会导致相关菌群的遗漏，甚至包括优势菌群；如果引物扩增的片段可变性不足，就难以通过DGGE/TGGE/SSCP获得全面准确的菌群多样性信息。因此既要求引物要从研究体系中各微生物种群共有的保守序列中选取，又需要引物扩增的片段在研究体系的各菌群中具有足够的可变性。目前针对rDNA序列已经开发出了一些常用的PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物，而当前大多数菌群多样性研究往往只选择其中的一对引物开展——并未考查该引物是否适合于所研究体系，或者是否有更加合适的引物。有研究表明，选择不同的PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物进行研究结果往往存在差异。针对适合于所研究体系菌群多样性研究的PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物的选择，有关研究表明可以采用比较不同类型的引物进行多样性分析的效果，然后从中筛选出最佳的引物；或者采用多对引物分别进行PCR-DGGE/TGGE/SSCP分析，最后共同解析菌群多样性。然而多对引物择优或者联用的研究策略将大大增加工作量，此外还是具有一定的盲目性。因此应该采用从所研究的菌群体系出发选取或者设计PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物的策略，这样则选取或者设计得到的引物将具有很强的针对性，同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于序列特性分析的PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物筛选方法，从而实现对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物筛选方法，其特征在于：从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物筛选，筛选指标包括引物匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量。

具体步骤如下：

步骤1：确定所研究体系涉及的微生物种属。

所研究体系涉及的微生物种属可以结合文献报道和前期研究进行确定，因此该方法更加适用于体系较为明确的研究。此外相关分析是基于已知涉及的菌群信息及其现有的DNA序列，随着相关研究的开展、进行和深入，菌群信息及其DNA序列将会得到更新或者补充，因此可以采用同样的方法进行完善。

步骤2：根据研究需要选择特定的DNA片段，收集步骤1所述微生物种属的该DNA片段并找出现有的靶向该片段的系列PCR-DGGE/TGGE/SSCP引物对。

rDNA可变区常被选择作为菌群多样性研究的靶标片段，如采用16S rDNA的V3区研究细菌菌群多样性。而对于某一微生物种属，其特定DNA片段的检索最好是在专门的数据库中进行（如RDP：http://rdp.cme.msu.edu/ 和SILVA：http://www.arb-silva.de/ 等），所得序列将更加可靠和具有代表性；此外检索结果可能不止一条，应选择长度最长的作为代表。

步骤3：将步骤2中收集到的微生物种属的DNA序列和各引物对分别进行比对，分析各引物对的匹配情况。