[发明专利]一种鉴定药用植物三叶青的方法有效

专利信息
申请号: 201310373809.4 申请日: 2013-08-24
公开(公告)号: CN103421907A 公开(公告)日: 2013-12-04
发明(设计)人: 王一涵;陈川;姜维梅;傅承新 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人: 张法高;赵杭丽
地址: 310027 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 鉴定 药用植物 三叶青 方法
【说明书】:

技术领域

发明属于属于中药鉴定技术领域,具体地说是涉及一种利用核苷酸序列、聚合酶链反应引物鉴定三叶青的方法。 

背景技术

三叶青(Tetrastigmahemsleyanum Diels et Gilg),又名三叶崖爬藤,是中国特有的珍稀药用植物,分布于中国长江以南地区,为民间常用的中草药(中国植物志,1998)。其块根入药具有免疫调节、保肝、抗肿瘤、抗病毒、抗出血热、抗炎、镇痛及解热等多种功效。 

近年来,三叶青的抗肿瘤作用日益受到科研成果的认可,临床和民间用药的需求极大,价格节节攀升。然而三叶青的供应基本依赖野生资源,在利益的趋势下,其野生资源被滥采滥挖,资源蕴藏量的急剧下降(蹇京蓉,2012),无法满足市场需要。因此市场上出现了以廉价近缘种或土圜等常见伪品滥竽充数以谋取暴利的现象,难以保证用药的安全性和有效性。综合上述原因,有必要开发出一种实用性高,能快速、准确鉴定三叶青的方法。 

中药现代化步伐的加快对中药标准化提出了新的要求,标准化生产是中药产业发展和打入国际市场的关键,也是目前大力推行的GAP(Good agriculturing Practice, 中药材生产质量管理规范)的工作核心。而种质标准和科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提,因此中药材鉴定的方法要满足快速、准确和标准化等要求。然而目前三叶青的鉴定方法主要依据形态学(黄成勇,2002)和化学成分(李瑛琦等,2003),甚至仅依靠经验判断,尚未见到运用现代分子生物学手段建立DNA快速鉴定技术的研究报道。因此,有必要研发真实可靠的DNA分子标记快速鉴定三叶青,解决药材市场上真伪混杂、品质良莠不齐等问题。 

本发明涉及的部分参考文献: 

中国植物研究所.中国植物志第48卷第2册, 1998.北京, 科学出版社;

蹇京蓉.中药三叶青资源状况及其对策研究[J].中国药物经济学,2012(2):228-230;

黄成勇,辛宁,石艳辉.三叶崖爬藤的显微鉴别. 中药材, 2002, 25(8): 548-549;

李瑛琦, 陆文超, 于治国.三叶青的化学成分研究[J].中草药2003,34(11):982-983。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定三叶青的方法。本发明从遗传本质上客观准确地鉴定所有常见种源的三叶青。具体通过以下步骤实现: 

(1)提供用于三叶青鉴定的DNA片段,其核苷酸序列如SEQ NO 1所示。该核苷酸片段来源于ISSR通用引物UBC843扩增所得的三叶青特异性核苷酸序列。ISSR通用引物UBC843扩增的带型中,三叶青与近缘种相比有特异性条带存在,该条带在伪品土圜中亦不具有,因此能根据此条带区分三叶青和其他易混物种。该特异性核苷酸序列的结构特征如SEQ NO 1所示,除ISSR引物结合位点外长1773bp,其中带下划线的部分(49-69bp和1748-1766bp)分别为本发明的三叶青专一性聚合酶链反应引物Thk1和Thk2的结合位点。

该三叶青特异性核苷酸序列可通过如实施例1所述的方法得到;或者按已知的该序列核苷酸组成与排列,在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。 

SEQ NO 1: 

5’-aatcattctt ctgtgaaatc aaaacctgat gcaccataaa actggagatc gtattttcct        60

actcttgttt ctcatggcat catccaaaac ttccatgaaa tcgaactcat cagtggattc          120

ctacattttc ccgatttctt tgatttctcc tatttgcttt ccttgacaag gtgagaacag            180

tcggctcttc ctcctcgtac aagatatcat cttaatcgca tttagaattc tttgcccttt            240

tcaggatggt tcagcctttt cctcttgaga ttctctgttt ttgtattcaa atttgagttt             300

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