[发明专利]MDM2基因受体改造的T细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外细胞培养技术领域，具体涉及一种MDM2基因受体改造的T细胞（M-CIK）的制备方法。

背景技术

肺癌是当前世界各地发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在中国无论是新发病例还是死亡病例肺癌都排名首位，其中肺鳞癌约占原发性肺癌的30%左右，是来源于支气管上皮的一种恶性上皮性肿瘤。虽然治疗技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，除了部分早期的患者，几乎所有患者最终将出现新的转移病灶，手术及放化疗是其有限的治疗方法，不像肺腺癌还有分子靶向药物等治疗手段。因此，寻找新的有效的治疗手段，开发新一代的靶向性免疫细胞治疗肺鳞癌已成为一种新的趋势。

自体细胞免疫疗法是第四代抗肿瘤过继细胞免疫治疗方法，CIK（cytokine-induced killer，多种细胞因子诱导的杀伤细胞）细胞是其首选方案。该方法是将人外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。回输的免疫活性细胞可在体内长期生存，监视和清除体内的肿瘤细胞。开创了体细胞过继免疫治疗恶性肿瘤的新方法，在各种肿瘤的治疗中已展现出令人鼓舞的效果。

但不可避免地面临着以下这些问题：没有解决有效地在体外扩增T细胞的数量的问题，及不能产生足够量的杀伤肿瘤细胞的细胞因子，从而缺乏有效的杀伤肿瘤细胞的细胞毒性。因此，采用体外扩增T细胞治疗肺鳞癌的方法需要有一个新的突破，从而使这些T细胞能产生更强的抗癌能力以及更长期的治疗效果。

发明内容

为了解决上述现有技术所存在的问题，提高现有方法所得的CIK细胞对肺鳞癌的特异性和杀伤性，本发明提供了一种MDM2基因受体改造的T细胞的新制备方法以及该制备方法所得的M-CIK细胞，该细胞增殖能力强，MDM2受体表达高，对肺鳞癌细胞具有更强的识别能力和杀伤能力，对治疗肺鳞癌具有更强的靶向性作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明经过广泛研究和反复试验发现：1）大多数肺鳞癌过度表达MDM2(murine double mimute2)基因，占肺鳞癌总数的62%以上，且在其他类型肿瘤组织中也有阳性表达，促使肿瘤的发生发展，并且MDM2基因过度表达者肿瘤恶性度高，还会造成肿瘤对放疗、化疗的耐受，与不良预后有关。因此我们选择MDM2基因作为靶基因，用MDM2基因受体修饰T细胞受体；2）将MDM2基因受体通过慢病毒载体成功转染入培养成熟的单个核细胞（CIK细胞）后，对表达MDM2受体的CIK细胞进行有效扩增得到M-CIK。

一种MDM2基因受体改造的T细胞的制备方法，包括如下步骤：

（1）将MDM2基因受体通过慢病毒载体转染入培养成熟的单个核细胞CIK细胞；

（2）使表达MDM2受体的CIK细胞进行有效扩增得到M-CIK细胞，即获得所述MDM2基因受体改造的T细胞。

较佳的，所述慢病毒载体是用来表达一个由单链抗体、跨膜区域和一个细胞内信号区域联结组成的人造受体，即MDM2基因受体。

较佳的，所述MDM2基因受体是指通过2A肽序列与多种共刺激受体CD28，4-1BBL和CD80等相联结，从而可以增强MDM2基因受体在识别到肺鳞癌抗原后发出的抗肿瘤信号。

较佳的，所述成熟的单个核细胞是指将人体外周血中提取的单个核细胞采用IFN-γ、IL-1α、IL-2、CD3单抗等细胞因子刺激，培养成为成熟的CIK细胞；

进一步的，所述细胞因子IFN-γ、IL-1α、IL-2、CD3单抗的浓度分别为1000-2000U/ml、100-200U/ml、1000-2000U/ml、50-100ng/ml。

较佳的，所述有效扩增是指所得到的扩增细胞90%以上为有效M-CIK细胞（图1），50ml外周血14天扩增细胞量在10¹⁰个以上（图2）。

更佳的，所述有效M-CIK细胞是指MDM2受体表达率在90%以上，CD3+表型在90%以上，CD3+CD56+表型在20%以上（图3），对肺鳞癌细胞SK-MES-1的杀瘤率（效靶比为10:1）在90%以上（图4）。

本发明还提供了一种M-CIK细胞。