[发明专利]miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、医学和生物技术领域，尤其涉及一种miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

microRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，一个miRNA可有很多靶基因，而每个基因受多个miRNA调控。研究发现，编码调控miRNA的基因发生突变、缺失以及转录后调控失衡、启动子区DNA甲基化修饰及结合蛋白异常等引起miRNA的异常表达。miRNA表达异常会严重影响细胞信号转导途径的功效，导致细胞增殖和分化失去控制。针对miRNA的检测对于分子水平的基因表达的监控有重要意义，也可以为miRNA功能研究提供重要依据。

目前miRNA的检测方法主要有Northern Blot、原位杂交、基因芯片、荧光定量探针法；但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；原位杂交技术在一次实验过程只能检测有限的miRNA，仍然难以满足高通量要求；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵。荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。

发明内容

本发明的目的之一提供了一种用于miRNA检测的探针。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种miRNA检测探针，包括：

（1）杂交探针：其5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，所述tag标签序列和所述结合序列之间还设有待检测靶标miRNA反向互补序列；所述结合序列为polyA序列或为oligoCCA序列，其长度为8-20个碱基；

（2）信号探针：其5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG；所述polyT或oligoTGG是杂交探针中结合序列的反向互补序列；所述信号序列为Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列，其长度为60-90个碱基。

在其中一些实施例中，所述结合序列的长度为9-11个碱基。最优选为10个碱基。

在其中一些实施例中，所述信号序列的长度为为89-90个碱基。最优选为90个碱基。

本发明的另一目的是提供一种miRNA检测试剂盒。该检测试剂盒能够高灵敏高选择性检测靶标序列。

一种miRNA检测试剂盒，包括以下组份：

A、上述检测探针；

B、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与杂交探针5’端的tag序

列互补配对。

在其中一个实施例中，miRNA检测试剂盒还包括有生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP。

在其中一些实施例中，所述tag序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5中的一条或多条。

在其中一些实施例中，步骤（2）所述anti-tag序列与微珠之间连接有间隔臂序列，优选地，所述间隔臂序列为5～10个T的间隔臂序列。

本发明的另一个目的是提供一种检测miRNA的方法，该方法能实现目标miRNA的准确检测。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测miRNA的方法，包括以下步骤：

1）使用本发明上述检测探针中的杂交探针和信号探针，与生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP进行延伸反应，形成信号标记复合体；

2）与待检测的样本杂交；

3）加入上述包被有anti-tag序列的微珠进行捕获反应；

4）RNase酶切消化；

5）用SA-PE进行孵育，检测。

本发明的主要优点在于：

1）本发明的miRNA检测探针构建方法，能够适用于不同的目标检测miRNA，灵敏度高，特异性好，适用性强。