[发明专利]一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法

权利要求书

1.一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，该犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤：

步骤一、犊牛发生腹泻后病料的采集与标记；

步骤二、细菌的增菌，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养，菌体的处理；

步骤三、设计两对诊断性引物eaeA，P1：5’-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3’；P2：5’-CCAGACGATACGATCCAG-3’，预期扩增出的目的片段大小；bfpA基因，P1：5’-TGTATATTGGGCAGACC-3’；P2：5’-CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小；

步骤四、PCR扩增反应；

步骤五、记录革兰氏染色镜检结果，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板生长结果，毒力基因eaeAPCR结果；

步骤六、将eaeA所测序列与GeneBank中的序列进行比对，对eae序列进行分析，对核苷酸序列分析；

步骤七、将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域。

2.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，病料的采集与标记的具体方法为：

犊牛发生腹泻后，用干净竹签选取含有粘液、脓血病变成分的粪便，也可用棉签取黏附在肛门附近的腹泻粪便，装于无菌的容器内，低温保存，并对病料进行编号，一月龄1-24号，10天内25-30号。

3.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，细菌的增菌方法为：

在无菌操作台，用接种环取采集的粪便于LB液体培养基中，放入气浴恒温振荡器中，于37℃缓慢震荡过夜。

4.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为：

用接种环挑取增菌液，在普通琼脂平板进行划线；

置于37℃恒温培养箱内培养24h，每板选取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，选取阴性菌；

选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、37℃恒温培养箱内培养24h，观察结果。

5.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，菌体的处理的方法为：

将每一株菌接在两支LB培养液中，过夜培养，一支进行5次离心，弃上清，收集菌体，加入100μL灭菌水，悬浮菌体后100℃煮沸5min，离心作为PCR模版，在-70℃冰箱保存。

6.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，扩增反应条件：

eaeAPCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，44.4℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；

bfpAPCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；

PCR产物用1%琼脂糖凝胶，100V电泳30min，凝胶成像系统拍照观察结果。

7.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，经革兰氏染色镜检，得到革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。

8.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，判定非典型性EPEC的方法为：

从分离鉴定的大肠杆菌中，利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有eaeA基因、bfpA无带，判定为非典型性EPEC。