[发明专利]重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法与应用

权利要求书

1.大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B，已于2013年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013225。

2.重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B，其特征在于由表达大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B基因的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B的重组表达产物制得，其理论分子量约11kDa。

3.如权利要求2所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）挑取大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B单菌落在培养基中振荡培养过夜，第二天按照1%的比例将此过夜培养物接种于100mL培养基中，振荡培养至OD₆₀₀达0.4～0.6，加入诱导物IPTG至终浓度为0.1～1mM，继续振荡培养后将培养物离心收集菌体，用结合缓冲液洗涤菌体3次后再用结合缓冲液重悬菌体，得结合缓冲液重悬的菌体溶液，所得样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE检测大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因的表达；

2）将步骤1）得到的结合缓冲液重悬的菌体溶液于冰浴中进行超声破碎，超声后产物离心分离上清与沉淀分别制备样品经SDS-PAGE分析证实大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B基因的表达产物大量存在于超声后上清中，说明其在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B中得到可溶性表达；

3）利用固定化金属离子亲和层析介质纯化上诉诱导表达培养物中大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B基因的重组表达产物：将步骤2）中制备的超声后上清液按每10mL加入1mL固定化金属离子亲和层析介质于4℃结合过柱，控制流速在2～5mL/min，用5～10倍柱体积含10～20mM咪唑的结合缓冲液洗涤后再用含20～40mM咪唑的结合缓冲液洗涤杂蛋白至OD₂₈₀小于0.01，加入1mL含500～1000mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，重复1次，得到的纯化产物经SDS-PAGE检测后为大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因大肠杆菌表达产物，即重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B。

4.如权利要求3所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述培养基的组成按质量体积比计算为1%的NaCl，1%的蛋白胨，0.5%的酵母提取物，100μg/mL的氨苄青霉素，pH7.0。

5.如权利要求3所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述将培养物离心的条件为于6000r/min，4℃离心10min；所述振荡培养的条件是于37℃以180～250r/min振荡培养；所述继续振荡培养的条件是于16～25℃以180～250r/min振荡培养过夜。

6.如权利要求3所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述结合缓冲液的组成为20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.4。

7.如权利要求3所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述超声破碎的条件为于输出功率50～70W，5S超声/5S静息的循环条件超声10min；所述超声后产物离心的条件可为于12000r/min，4℃离心20min。

8.如权利要求3所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述洗脱缓冲液的组成为20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.4。