[发明专利]重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，尤其是涉及一种重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)是一类专门抑制活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白酶水解作用的抑制因子，对半胱氨酸类组织蛋白酶具有抑制作用(1.郑常文，董长江，唐宏力等.猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究.四川大学学报(自然科学版),1993,3:015)。

水产品加工，尤其是鱼糜加工过程中残留的半胱氨酸类组织蛋白酶在鱼糜凝胶的加热制备过程中会降解鱼糜中的肌球蛋白，导致凝胶劣化(2.Olafsdottir G,Martinsdóttir E,et al.Methods to evaluate fish freshness in research and industry.Trends in Food Science&Technology,1997,8(8):258-265)，降低鱼糜制品的品质。造成鱼糜凝胶劣化的半胱氨酸类组织蛋白酶主要有组织蛋白酶B、L、L-like以及与肌原纤维结合的丝氨酸蛋白酶（3.侯鲁娜，陈学云，聂小华，刘璘.鱼糜凝胶劣化相关组织蛋白酶的研究进展.食品科技，2010，35：164-167）。目前，水产品加工行业中往往通过添加一些化学试剂或从猪、牛血浆及鸡蛋清、马铃薯中制得的cystatin来抑制凝胶劣化，增强产品凝胶强度。抗冻剂、还原剂、氧化剂、凝胶增强剂等化学试剂的使用尽管在一定程度上可以帮助凝胶的形成并增强凝胶强度，但不能从根本上解决由内源性蛋白酶引起的凝胶劣化问题。从猪、牛血浆及鸡蛋清、马铃薯中制得的cystatin价格昂贵，在加工过程中会使产品产生不良的风味和色泽，且由于禽流感、疯牛病的流行，使人们对含有这些来源的食品安全心存顾虑，因此迫切需要寻找新型、安全、高效、成本低廉的食品级cystatin。来源于鱼类自身的cystatin可通过专性抑制鱼类半胱氨酸类蛋白酶的活性有针对性地高效解决鱼糜制品加工过程中的凝胶劣化问题，利用基因工程表达的重组鱼类cystatin则可大大降低产品制备成本,在鱼糜加工业具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B。

本发明的第二目的在于提供重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B及其制备方法。

本发明的第三目的在于提供重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B在制备水产品加工添加剂中的应用。

所述大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B已于2013年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013225，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B（rLyccystatin）由表达大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B基因的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B的重组表达产物制得，其理论分子量约11kDa。

所述重组大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B的制备方法，包括如下步骤：

1）挑取大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B单菌落在培养基中振荡培养过夜，第二天按照1%的比例将此过夜培养物接种于100mL培养基中，振荡培养至OD600达0.4～0.6，加入诱导物IPTG（Isopropylβ-D-1-Thiogalctopyranoside，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为0.1～1mM，继续振荡培养后将培养物离心收集菌体，用结合缓冲液洗涤菌体3次后再用结合缓冲液重悬菌体，得结合缓冲液重悬的菌体溶液，所得样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE检测大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因的表达；

2）将步骤1）得到的结合缓冲液重悬的菌体溶液于冰浴中进行超声破碎，超声后产物离心分离上清与沉淀分别制备样品经SDS-PAGE分析证实大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B基因的表达产物大量存在于超声后上清中，说明其在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pET-his-Lyccystatin B中得到可溶性表达；