[发明专利]一种快速检测金银花成分掺伪量的方法

权利要求书

1.用于鉴定金银花成分掺伪量的PCR扩增及焦磷酸测序特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，测序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。

2.一种采用权利要求1所述特异性引物，快速鉴定金银花成分掺伪量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的2条PCR特异引物及Master Mix，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；

反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(2)采用权利要求1所述的焦磷酸测序测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL；

(3)测序时间8～10min，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol／L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。