[发明专利]一种快速检测金银花成分掺伪量的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及中成药、食品、保健品中金银花成分掺伪量的检测方法，是一种利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品标志性核酸位点定量检测的方法。

背景技术

来源纯正、品质优良的药用植物资源是中药现代化和标准化生产的重要前提之一。近年来不断出现中药材掺伪事件，不仅损害了中医药的信誉和消费者的信心，更使误病害人，造成巨大的经济损失。本发明以大宗药材金银花为材料，基于DNA条形码标记中Sentinel-base位点，结合焦磷酸测序分析技术，建立快速、高通量、自动化的金银花掺伪鉴别方法，为规范、监管药材市场提供技术支撑。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代技术。在遗传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是“黄金标准”，其权威性比其他DNA分析方法如Northem杂交，基因芯片和实时定量PCR(Taqman探针)技术更好。其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单的特点，非常适合用于对蔬菜杂交品种种子纯度的鉴定。迄今为止，尚未有成功利用焦磷酸测序技术鉴定中药掺伪量的报道。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种金银花成分掺伪量检测方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于检测金银花成分掺伪量的PCR扩增及焦磷酸测序特异性引物，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，测序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。

本发明所述快速检测金银花成分掺伪量的方法，该方法以供试样品基因组DNA为模板，对已知目标片段进行PCR扩增分析，结合应用焦磷酸测序技术对标志性核酸位点进行AQ分析及掺伪量计算，其包括如下步骤：

(1)采用引物正向、反向序列的2条PCR特异引物及Master Mix，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；

反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(2)采用焦磷酸测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL；

(3)测序时间8～10min，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。

本发明所述的检测方法，其中的Binding Buffer47μL指的是：10mmol／L Tris-HCl，2mol／L NaCl，l mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6的溶液；Annealing Buffer38.8μL指的是：20mmol／L Tris-AC，2mmol／L MgAc2，pH7.6的溶液。

本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol／L的贮存液，工作浓度为10μmol／L。

本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。