[发明专利]一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法

权利要求书

1.一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：      

1）以栽培菊花作母本，野菊作父本进行远缘杂交，分别于授粉后12 d和18 d剪下已授粉的花序进行取样，授粉后12 d时取发育正常、饱满的子房，授粉后18 d时分别取发育正常、饱满的子房及发育异常、不饱满的子房；取样后立即在液氮中预处理1~2 h，然后于-80℃贮存；

2）将步骤1）所取得的样品分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质，于-80℃保存；

3）将授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述的野菊为菊花脑。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1）所述远缘杂交方法为：选定父母本，在母本上选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头，并严格进行套袋，待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时，于晴天10~15时收集已套袋的父本新鲜花粉，对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为：取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15,000 g，4℃下离心15 min，取上清液，向上清液中加入洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静止0.5~1.5h；然后在15,000 g，4℃下离心15 min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ洗涤，-20℃静止30 min以上，重复用洗涤液Ⅱ洗涤1~2次后冷冻干燥沉淀，将获得的蛋白质干粉于-80℃长期保存。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的提取液为：8M尿素、2%硫脲、1% Trition X-100、50 mM NaCl、20 mM Tris，pH =8.0；所述的洗涤液Ⅰ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT和10% TCA；所述的洗涤液Ⅱ为：-20℃预冷丙酮加0.07% DTT。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白主要包括以下步骤：样品前处理、第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，在利用生物信息学手段对数据分析基础上，获得与胚胎败育密切相关的蛋白；所述的样品前处理包括以下步骤：蛋白定量、蛋白纯化、蛋白酶解、肽段iTRAQ标记、去除残留标记试剂、脱盐。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的第一维高pH反相色谱分离的过程为：将样品前处理后得到的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0-30 min，流动相由5%B升至35%B；30-32 min，由35%B升至80%B；32-35 min保持80%B，35-36 min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色谱柱，高pH反相梯度共50 min；流速为200 μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214 nm波长检测；色谱系统死时间(t0)为2 min，由4 min开始每隔2 min使用EP管收集馏分，最后第32-36 min收集为一管，共计收集15管，分别干燥成肽段粉末；所述的高pH流动相A为20 mM甲酸铵，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH；高pH流动相B为20 mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH。