[发明专利]一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及菊花杂交育种与蛋白质组学领域，涉及菊花远缘杂交后胚胎在不同发育时期正常与败育胚胎差异蛋白的快速检测与鉴定方法，具体地说涉及一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法。

背景技术

菊花原产中国，是我国十大传统名花、世界四大切花和十大盆花之一，在花卉生产中占有十分重要的地位。目前，国内菊花品种高达数千个，但多数观赏性状优良的品种各种抗性较差，而多数近缘种属的野生资源中却含有许多栽培菊品种所缺乏的优良性状，为此运用栽培品种与野生资源进行远缘杂交的方法将是改良菊花抗性的有效途径。

然而，已有研究表明，菊花远缘杂交中经常遇到各种生殖障碍，受精前障碍(pre-fertilization barriers)和受精后障碍(post-fertilization barriers)是导致菊花远缘杂交结实率低的主要因素，其中受精后障碍发生更为普遍，即杂交后虽能够完成受精作用过程，但胚胎发育过程遇到障碍，导致发育停止或者完全坏死，即胚胎败育，最终引起杂交不结实。

目前的研究主要集中在对胚胎发育的形态结构、组织化学等方面，如胚胎败育发生的时期和胚胎败育的组织结构特征等，很少从更深层次上开展研究。由于这些形态、组织等方面的变化从根本上说还是由基因和蛋白表达水平上的变化所引起，因此为了能真正弄清胚胎败育的机理，除了从细胞与结构水平上开展相关的研究外，还需要从分子水平上开展更为深入的研究。控制植物胚胎发育的基因通常高达数千种，直接从基因水平上着手很难找到控制胚胎败育的相关基因。而在最近10多年兴起与逐渐完善的蛋白质组学(proteomics)技术一方面可以同时分辨和鉴定上千个甚至更多的蛋白质，另一方面因为胚胎败育与蛋白质表达密切相关，因此，蛋白质组学将是研究植物胚胎败育较为理想的手段，准确、快速地鉴定出正常胚胎与败育胚胎的关键差异蛋白有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法。鉴定菊花正常胚胎与败育胚胎差异蛋白的方法，为克服菊花远缘杂交受精后障碍研究提供分子基础，实现不同菊属间各种优良基因的转移。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，包括以下步骤： 

1）以栽培菊花作母本，野菊作父本进行远缘杂交，分别于授粉后12 d和18 d剪下已授粉的花序进行取样，授粉后12 d时取发育正常、饱满的子房，授粉后18 d时分别取发育正常、饱满的子房及发育异常、不饱满的子房；取样后立即在液氮中预处理1~2 h，然后于-80℃贮存；

2）将步骤1）所取得的样品分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质，于-80℃保存；

3）将授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析。

所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述的野菊为菊花脑。

所述步骤1）所述远缘杂交方法为：选定父母本，在母本上选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头，并严格进行套袋，待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时，于晴天10~15时收集已套袋的父本新鲜花粉，对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。

步骤2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为：取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15,000 g，4℃下离心15 min，取上清液，向上清液中加入洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静止0.5~1.5h；然后在15,000 g，4℃下离心15 min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ洗涤，-20℃静止30 min以上，重复用洗涤液Ⅱ洗涤1~2次后冷冻干燥沉淀，将获得的蛋白质干粉于-80℃长期保存。