[发明专利]酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记和SCAR标记及其获得方法

权利要求书

1.酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记，其特征在于所述RAPD标记的序列为序列表1。

2.酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记，其特征在于以权利要求1的酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到的，SCAR标记的序列为序列表2。

3.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于所用SCAR引物的序列为：SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。

4.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于上述PCR扩增反应的条件为Taq酶1.0U、引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD标记DNA模板10ng；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。

5.获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记的方法，其特征在于包括下述步骤：

1)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株；

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA；

3)基于BSA法与RAPD法，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记；

4)回收抗酸性RAPD特异片段，与pMD119-T载体连接后测序得到RAPD标记。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤1)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同pH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述能稳定扩增的引物序列为S200：TCTGGACGGA。

9.获得酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记的方法，其特征在于包括下述步骤：以SCAR引物将RAPD标记进行PCR扩增。