[发明专利]酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记和SCAR标记及其获得方法

说明书

技术领域

本发明属于酿酒微生物生物技术工程，特别涉及酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记、SCAR标记及其获得方法。 

背景技术

苹果酸-乳酸发酵(Malolactic Fermentation，简称MLF)是葡萄酒酿造中非常关键的二次发酵过程，它包括有机酸、糖类代谢、多糖和氨基酸的代谢作用，还涉及到许多酶类，比如糖苷酶、酯酶、蛋白酶等，这些代谢反应产生多样化的挥发性物质，从而改善和修饰葡萄酒的感官特性。MLF过程主要有酒酒球菌主导。酒酒球菌发挥优良特性必须要抵抗葡萄酒中恶劣的生存环境，产生一定的抗胁迫能力，比如抵抗低pH值胁迫、高酒精浓度胁迫、高S0₂浓度胁迫和营养物质匮乏胁迫等。酒酒球菌在葡萄酒中的抗胁迫能力的大小也就是存活量的多少，是影响MLF活性的关键，因此对不良环境的抵抗能力成为优良菌株选育的重要参照指标。 

酒酒球菌的抗酸机制可以作为生物化学和分子生物学方法选育优良菌株的理论基础，然而酒酒球菌抵抗胁迫时有相当复杂的反应机制，目前本领域技术人员尚不清楚酒酒球菌在受到酸胁迫时的具体反应机制。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因片段的稳定遗传标记的方法，以及基于此方法获得的RAPD标记和SCAR标记。本发明所获得的标记序列是与酒酒球菌抗酸基因连锁的稳定遗传标记，为进一步揭示酒酒球菌抗酸基因的调控机制奠定理论基础，并且作为一级信息源可以用于选育优良的酒酒球菌菌株。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

首先，本发明公开了酒酒球菌菌株的RAPD标记，其序列全长为1000bp，序列的碱基排列见序列表1所示。该序列具有特异性，与酒酒球菌抗酸性状有紧密联系，可以用作酒酒球菌抗酸性研究的标记序列。 

其次，在上述RAPD标记的基础上，本发明还公开了酒酒球菌菌株的SCAR标记，将酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到，其序列如序列表2所示。 

其中所用SCAR引物的序列为：SAl：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。 

相对于RAPD标记，SCAR标记稳定性更好、可重复性强。SCAR标记表现为扩增片断的有无，是一种显性标记，能更方便、快捷用于快速检测大量个体。 

其中，上述的RAPD标记到SCAR标记的转化条件为PCR扩增反应，采用Taq酶1.0U、SCAR引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD标记DNA模板10ng；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸5min。 

相应的，在上述基础上，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记的方法，包括下述步骤： 

1)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株； 

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA； 

3)基于BSA法与RAPD法，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记； 

4)回收抗酸性RAPD特异片段，与pMD119-T载体连接后测序得到RAPD标记。 

其中，步骤1)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同pH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。 

其中，步骤2)的CTAB法是生物领域常用的用来提取DNA的方法，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，在高离子强度的溶液中(>0.7mol／L NaCl)与蛋白质和多聚糖形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。 

其中，步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。