[发明专利]一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域，具体涉及的是一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法。

背景技术

合成生物学是一门新型的交叉学科，是指通过重头设计并构建新的遗传组件、设备和系统，或对现有的、天然的生物系统进行重新设计和改造，以达到利用工程化的遗传系统或生物模型来处理信息、合成化合物、生产能源、提供食物以及改善环境等目的。合成生物学的工程技术本质是按照设计好的蓝图重新组装分子元件，并转入细胞，使这些工程化的细胞执行新的功能。将基因元件（启动子、开放阅读框、终止子、核糖体结合位点等）依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。DNA组装的诞生加速了合成生物学功能元件库（如启动子库）以及生物合成途径的人工构建。随着合成生物学的快速发展，对异源模块在底盘细胞中表达的优化和适配的需求不断增加。

由于合成生物学的研究模式是“转移一组基因，表达一种蛋白”，因而需要在更大规模更多层次上涉及到细胞网络，如代谢网络等。传统的通过代谢工程网络分析设计相关模块已经无法满足合成生物的需要，不同来源模块之间的组合适配成为重要的应用方法之一。在此过程中,底盘生物本身代谢网络与新生物功能途径相互协调,相互适配，最终得到服务于特定生产和生活需要的“细胞工厂”提供了重要基础。2010年Gregory组发表在Science上的研究利用组合适配的方法将紫衫二烯在大肠杆菌中的表达量提高了15000倍，达到1克/升。其方法为优化大肠杆菌内源MEP途径中关键酶和外源GGPP合成酶、紫衫烯合成酶的启动子组合、质粒拷贝数组合，共产生组合数为32个。2012年，Huimin Zhao组通过启动子突变产生不同强度的启动子库，利用酵母内源同源重组得到带有突变启动子的不同组合，利用一次酵母转化得到含有不同组合的混菌库。在混菌中对表型进行筛选得到一株在木糖培养基上高产乙醇的工业菌株。通过对得到的优势菌株提取酵母质粒进行测序得到最优的启动子组合方式。

合成生物学现有的对模块的组合研究方式多采用将所有模块组装到同一质粒上，并转入底盘菌株中进行筛选。这种构建模式的优势之处在于所构建途径比较稳定、各模块表达量比较平衡。适用于已对所构建途径已有一定了解、能通过特定组合设计完成构建的途径。但是同时也存在诸多缺点：组合后的质粒很难对中间某一模块进行替换或改造，所涉及的研究范围相对比较片面；在所涉及模块数量较多或模块组合数较多的情况下，对所有模块及组合进行组装工作量巨大；大部分组装方法均需对所有组装模块进行测序，价格昂贵；受组合类型和数目的限制，难以对某一途径的所有步骤及步骤之间的相互联系进行系统的研究。

基于以上原因，目前需要一种可以将模块进行系统的排列组合并快速筛选的新方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有不足，提供一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种酿酒酵母模块共转化组合筛选方法，包括以下步骤：

（1）每次从待筛选的启动子元件库、基因元件库和终止子元件库中各选一个元件组装到带有不同筛选标记的质粒上得到模块，不同的模块中，相同基因元件所选筛选标记相同，由模块组成模块库，进行测序确保模块库中的各模块序列正确；

（2）对所述模块库中的模块进行排列组合设计；

（3）利用酿酒酵母质粒共转化技术，按照步骤（2）的设计，将与所述设计对应的模块转入酿酒酵母底盘菌中；

（4）将步骤（3）转化后的菌在选择缺陷型培养基上培养，得到步骤（2）所有排列组合的正确酿酒酵母转化子；

（5）结合目标性状的具体特征筛选得到高效模块组合的酿酒酵母转化子。

待筛选的基因元件库中的基因元件优选为对酿酒酵母目标途径产生影响的酿酒酵母内源基因或外源基因。

内源基因元件优选木酮糖激酶基因。

外源基因优选为毕赤酵母木糖还原酶基因、毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因、紫色杆菌素VioA基因或紫色杆菌素VioB基因。

筛选标记优选为Ura3、His3和Leu2或选任意2个。

质粒是在酿酒酵母中可自主复制的着丝粒型质粒或在酿酒酵母中可自主复制的游离型质粒。