[发明专利]一种提高牛虻抗血栓酶kfpase生物活性的复性方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及牛虻抗血栓酶kfpase的复性方法。

背景技术

血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发了针对血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步骤而起作用的基础和临床药物，但是很多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。

牛虻抗血栓酶kfpase为一种单链蛋白，其表观分子量为27kDa。实验表明牛虻抗血栓酶kfpase具有明显的抗静脉血栓的作用。该工作对有潜力开发成为新型单组份抗血栓药物的牛虻抗血栓酶kfpase进行了较为系统的理化性质研究，为该酶的进一步开发和研究奠定了基础。

原核表达系统作为一种成熟的蛋白表达系统，因其表达量高，操作简便和成本较低一直以来都受到工业化生产的青睐。因此借助大肠杆菌系统进行基因工程重组表达具有成本低，大规模发酵容易等优点，但重组蛋白在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物不具有生物活性，往往需要进行繁琐的蛋白质复性实验才能获得部分活性。蛋白质在折叠复性中存在一个难以调和的矛盾，那就是蛋白质的折叠和聚集是个竞争过程。当疏水基团的结合发生在在蛋白质内时即为折叠，发生在分子间时就为聚集。后者是个不可逆的过程，往往形成不溶性沉淀。蛋白质的折叠是单分子的一级反应，聚集是双分子或者多分子反应，通常为二级乃至更高级的反应，因此随着蛋白质浓度的提高聚集的倾向将大于折叠的倾向。基因工程的产业化首先要求能在高浓度下复性，蛋白浓度过低无疑会增加后处理的繁琐，提高成本；其次，要保证高的活性收率，即复性的产物与天然结构完全相同；再次，需要高的蛋白收率，尽量减少蛋白质折叠过程中的聚集沉淀。

蛋白质复性的经典方法一般采用稀释和透析法，前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求很低的蛋白质浓度，而后者操作繁琐，不利于放大。超滤法复性时可以讲变性剂用复性缓冲液连续置换，使变性剂浓度缓慢降低，而蛋白浓度不会明显降低，而且便于自动化操作，但剪切力可能导致复性好的蛋白重新变性而降低活性收率。其他改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性，它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。

近年来，固相复性和层析复性的方法被提出且逐渐受到重视，因为它有如下优越性：减少蛋白质互相聚集的机会，提高蛋白质复性浓度；便于去除变性剂；打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行；使复性和纯化同时进行；便于自动化、规模化生产。

凝胶过滤层析是一种在蛋白分离纯化领域常用的技术，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

发明内容

本发明的目的在于克服稀释复性和透析复性的缺点，为了提高蛋白的活性同时又提高了蛋白的收率，而且变性蛋白在高浓度下复性，不易产生沉淀的目的，从而提供一种操作简单、利用凝胶过滤层析复性蛋白的方法。

本发明的方法利用凝胶过滤层析复性蛋白的，包括如下步骤实现的：

(1)柱平衡：用流动相I平衡凝胶过滤柱；泵入5％-10％柱体积的流动相II；其中流动相I为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20-50mmol／L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol／L，还原型谷胱甘肽1-3mmol／L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol／L，流动相II为尿素6-8mol／L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20-50mmol／L，pH8.0-9.5，L-精氨酸200-500mmol／L，还原型谷胱甘肽1-3mmol／L，氧化型谷胱甘肽0.2-0.6mmol／L；

(2)上样：泵入变性蛋白；

(3)洗脱：继续用流动相I洗脱凝胶过滤柱，蛋白在通过凝胶过滤柱时，逐渐将尿素的浓度降低，进而蛋白有足够的时间折叠成天然的形态。

整个复性过程是在AKTA上运行的，所有的流动相使用之前都通过了0.22μm的膜进行过滤，凝胶过滤所选的介质为Superdex75、Superose6或者Sephacryl S-200，步骤(1)中的柱体积为400ml。